【摘 要】
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环状RNA（circRNAs）是一类特殊的非编码RNA分子,能够调控许多不同的生物学过程。骨骼肌是动物躯体的重要组成部分,骨骼肌的生长发育水平会直接影响动物产肉的数量和品质。骨骼肌的生成是一个复杂的过程,主要受肌原性调节因子和各种非编码RNA的调控。秦川牛是我国具有代表性的地方黄牛品种,具有优秀的肉用价值。circRNA能够调控牛成肌细胞的生长发育,因此探究circRNA在秦川牛骨骼肌生长发育过程
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31772574,31972558）； 山东省农业良种工程项目（2020LZGC014）；
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环状RNA（circRNAs）是一类特殊的非编码RNA分子,能够调控许多不同的生物学过程。骨骼肌是动物躯体的重要组成部分,骨骼肌的生长发育水平会直接影响动物产肉的数量和品质。骨骼肌的生成是一个复杂的过程,主要受肌原性调节因子和各种非编码RNA的调控。秦川牛是我国具有代表性的地方黄牛品种,具有优秀的肉用价值。circRNA能够调控牛成肌细胞的生长发育,因此探究circRNA在秦川牛骨骼肌生长发育过程中的调控机制对提高牛肉的产量和品质具有重要的意义。本研究通过对实验室前期的测序数据分析,成功筛选出一个在秦川牛胎牛和成年牛两个时期具有差异表达的circRNA,根据其母源基因将其命名为circACTA1。本研究选择circACTA1为研究对象,通过构建circACTA1的过表达载体以及合成circACTA1的干扰片段来探究circACTA1在秦川牛成肌细胞中的功能及作用机制。主要研究结果如下:1.circACTA1在牛成肌细胞中的鉴定与功能探究circACTA1来源于ACTA1的第二和第三外显子,通过正反向引物扩增,RNase R处理及放线菌素D处理验证circACTA1的真实性,结果表明circACTA1是真实存在的。表达特性分析显示,circACTA1在胎牛和成年牛的各个组织中均有表达,且在成年牛肌肉组织中的表达要高于胎牛肌肉组织中的表达。对circACTA1的功能验证表明,circACTA1能够抑制牛成肌细胞的增殖,促进牛成肌细胞的凋亡和分化,核质分离试验表明,circACTA1主要位于细胞质中。2.circACTA1通过吸附miR-199a-5p和miR-433调控牛成肌细胞的增殖凋亡和分化RNAhybrid预测发现miR-199a-5p和miR-433存在circACTA1吸附的靶点,双荧光素酶报告试验和RIP试验表明circACTA1能够作为miR-199a-5p和miR-433的海绵。功能试验验证表明miR-199a-5p和miR-433能够促进牛成肌细胞的增殖抑制牛成肌细胞的凋亡和分化,而circACTA1能够逆转这些作用。3.circACTA1通过吸附miR-199a-5p和miR-433调控MAP3K11/MAP2K7/JNK通路Target Scan 7.2预测发现MAP3K11和MAPK8可能是miR-199a-5p和miR-433直接作用靶点,双荧光素酶报告试验表明miR-199a-5p和miR-433能够分别与MAP3K11和MAPK8直接结合。功能验证表明,MAP3K11和MAPK8能够抑制牛成肌细胞的增殖作用、促进牛成肌细胞凋亡和分化。通过RT-q PCR和WB试验验证circACTA1对MAP3K11/MAP2K7/JNK通路的激活作用,结果表明过表达或干扰circACTA1能够激活或抑制MAP3K11/MAP2K7/JNK通路上相关基因的表达。4.circACTA1对小鼠的肌损伤修复的作用研究Clustal Omega分析发现circACTA1在其他物种中有较高的相似性,琼脂糖凝胶验证表明circACTA1在羊和小鼠中均存在。构建小鼠肌损伤修复模型验证circACTA1在小鼠的肌损伤修复中的作用,结果表明circACTA1能够增强小鼠肌损伤后的修复作用。总之,circACTA1通过吸附miR-199a-5p和miR-433激活MAP3K11/MAP2K7/JNK通路进而抑制牛成肌细胞的增殖促进牛成肌细胞的凋亡和分化,这一研究进一步完善了肌生成过程中的分子调控机制,为肉牛的肌肉发育以及育种提供了新的见解。
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