葡萄是世界上最重要的经济水果之一,我国乃至世界上栽培的主流品种大都为品质优良但易感病的欧洲葡萄(Vitis vinifera),也易感染由寄主广泛的腐生菌灰霉菌(Botrytis cinerea)引起的病害,尤其随着我国葡萄设施栽培的推广,灰霉菌严重威胁着多地的葡萄产业,造成了巨大的经济损失。目前化学防治依然是生产实践中防治灰霉菌的主要手段,因此寻找长期有效的抗灰霉病育种资源,培育优良的抗灰霉病葡萄新品种已经成为研究重点。目前人们对抗灰霉病葡萄种质了解较少,特别是中国丰富多样的野生葡萄种质资源抗灰霉菌水平的调查,并且关于葡萄抗灰霉菌的特征和抗病机制研究也比较欠缺。本研究对中国野生葡萄种质叶片抗灰霉病水平进行了调查,选取高抗灰霉菌的中国野生葡萄种质,以高感灰霉菌的欧洲葡萄为对照,分析与灰霉菌互作过程中灰霉菌生长发育、活性氧及抗氧化酶系反应的差异;然后利用RNA-Seq测序技术,对受灰霉菌感染后不同时期的不同抗性葡萄叶片中基因表达情况和差异表达基因可能参与的生物学功能进行了详细地分析研究,这为培育抗灰霉病的优良葡萄新种质提供了参考依据。主要结果如下:1.对包括30份中国野生葡萄种质在内的共41份葡萄种质抗灰霉菌水平的调查和鉴定,证明了中国野生葡萄种质资源中存在对灰霉菌具有抗性的葡萄基因型,所调查的欧洲葡萄大多不抗灰霉病。抗性最高的6个基因型均为中国野生葡萄种质,它们分别是秦岭葡萄(V.sp.(Qinling grape))平利-5、燕山葡萄(V.yenshanensis)燕山-1、蘡薁葡萄(V.adstricta Hance)泰山-2和山葡萄(V.amurensis Rupr)双优、通化3号和泰山-11。2.高抗灰霉病的中国野生葡萄平利-5和双优可以将灰霉菌的侵染活动限制在侵染发生的早期(接种叶片后24 h之前),而灰霉菌在高感病欧洲葡萄V.vinifera.cv红地球上建立了直接有效的腐生互作关系;受侵染的中国野生葡萄平利-5表现抗灰霉菌,生成了极少量的ROS(活性氧)并且及时有效地提高了抗氧化酶活性,而感病的欧洲葡萄红地球易感灰霉菌和遭受持续ROS的积累与其低水平的抗氧化能力有关。3.高抗灰霉病的中国野生山葡萄双优和高感灰霉病的欧洲葡萄红地球为研究材料,利用RNA-Seq技术对感染灰霉菌的红地球和双优进行转录组测序。比较分析测序结果得到7289个差异表达基因,接种8小时后双优中差异表达基因数量显著大于红地球,但总体上受灰霉菌诱导后红地球发生了更大的转录改变。通过GO、KEGG pathway分析对差异表达基因的功能进行研究,发现在两种不同抗性葡萄与灰霉菌互作过程中信号、结构、代谢等多层面的生物学过程均发生了改变。4.受灰霉菌侵染后感病的欧洲葡萄红地球中包括ja/eth、aba在内的多个激素信号路径同时被显著诱导,在抗病的中国野生山葡萄双优中被诱导水平显著低于红地球,其中参与正调控抗灰霉菌的基因erf、wrky等和参与负调控的基因eds1、jaz等,在红地球中诱导水平均显著高于双优;这种多层次高水平的信号作用也许并不能赋予红地球抗灰霉菌的能力,相比之下,双优中相对较低的诱导水平可能使各种激素信号之间保持在相对适当的范围而促进了其对灰霉菌的抗性。5.受灰霉菌入侵的影响葡萄叶片细胞壁降解反应和细胞壁加固反应同时在两种抗性不同的葡萄叶片中被显著诱导;不同的是,在接种8小时后抗病的中国野生山葡萄双优的细胞表皮角质层和细胞壁合成过程被下调富集,在接种36小时后双优和感病的欧洲葡萄红地球中同时表现下调富集,但前者的下调程度明显低于后者;在侵染的早期(接种后4-8小时)双优可能通过表皮角质层和细胞壁的降低增加了叶片表面结构的渗透性,加速了识别防御反应和抗性物质(尤其是三萜化合物)的外排,促进了其对灰霉菌的抗性。6.抗病的中国野生山葡萄双优和感病的欧洲葡萄红地球受灰霉菌侵染后叶片中的次级代谢防御过程均被显著诱导,在红地球中被诱导水平更高,需要消耗更多的物质和能量;光合作用在红地球中比在双优中下降严重,但糖酵解和tca循环以及碳水化合物运输过程比双优中的更活跃;双优和红地球都可能通过glu代谢的gaba分流进行能量的补充,但前者对glu的消耗更多却无法提供补给。在与灰霉菌互作过程中,由于红地球对物质能量的更多需求可能导致了自身的过度消耗,尤其是glu;双优表现出对各种代谢过程的适时适量的调节和连续的glu的供应,可能既为自身防御反应提供了物质能量,又维持了自身代谢的平衡而得以实现对灰霉菌的抗性。7.感病的欧洲葡萄红地球叶片中呼吸爆发类似物1、gst、nudix羟化酶、abctransporters和mate被灰霉菌诱导的水平高于抗病的中国山葡萄双优,前者可能遭遇了比后者更严重的氧化胁迫及毒性物质的积累和细胞稳态的失衡;双优的生物节律过程未受影响,红地球中相关基因在侵染后12小时表现下调;此外,促进细胞衰老死亡的nudix羟化酶、nac、crk和scr等基因与抑制细胞死亡的mlo基因在两种葡萄叶片中同时被诱导表达,而且红地球中的差异表达水平显著高于双优;这些结果说明灰霉菌诱导了红地球中比双优更严重的细胞稳态失衡和衰老死亡。8.抗病的中国野生山葡萄双优叶片中一些和抗病相关基因的本底表达水平比感病的欧洲葡萄红地球高,也许赋予了双优对灰霉菌更强的基础抗性,使其与灰霉菌互作的第一时间即快速直接地启动防御反应发挥抗性作用,包括直接的结构抗性和能量来源,更强的维持细胞稳态平衡、dna修复和抑制细胞死亡的能力,更迅速的识别信号作用等防御反应;但由于红地球较弱的基础抗性迫使其与灰霉菌发生更长时间的互作以启动和发挥防御作用;相比之下,这种直接及时的和被迫延迟的防御反应也许分别是双优抗灰霉菌而红地球感灰霉菌的重要原因之一。