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肠道内环境的稳定与肠道菌群、机体的遗传因素和免疫反应密切相关。肠道共生菌在一定条件下可以打破肠道内环境的平衡状态,诱发T细胞介导的免疫应答,严重威胁人类和动物健康。肠道黏膜免疫系统在维持肠道内环境的稳定中发挥着关键作用,探索肠道共生菌对肠道黏膜免疫的调节作用及其机制已成为当前研究热点之。一。大肠杆菌E. coli NC 101和粪肠球菌E. faecalis是肠道共生菌,在人和动物的肠道均可分离得到。当机体免疫功能正常时,其与机体和谐共存;如果机体的免疫功能发生异常(如缺乏IL-10),会引发异常的肠道黏膜免疫反应,进而导致腹泻和肠炎。IL-10对调节肠道黏膜免疫系统的平衡起着至关重要的作用。IL-10基因敲除小鼠是研究肠道黏膜免疫应答的经典动物模型,其免疫系统在无菌环境中处于静息状态,但是在SPF环境中,在肠道共生菌的刺激下可以发生T细胞介导的免疫反应。本研究采用无菌级129品系野生型和IL-10基因敲除小鼠,开展了E.coliNC 101单一感染产生的IL-10对机体肠道黏膜免疫的调节作用及相关机制研究;探索了单一感染E.coli NC 101对C57B6品系IL-10基因敲除小鼠造成的肠组织病理变化及免疫应答状况;研究了 ATG16L1、MyD88和NOD2基因在单一感染丑coli NC 101时对抗原递呈功能的影响;并分别从体外、体内入手,研究了中药成分对自发性肠炎的改善作用及其黏膜免疫机制。试验I E. cE:. NC 101感染活化机体产生的IL-10对黏膜免疫细胞因子的调节作用研究本试验选用129品系无菌级野生型小鼠和IL-10基因敲除小鼠,研究肠道共生菌E.coliNC 101单一感染对激活机体免疫反应,分泌细胞因子的免疫调节作用。首先进行E.coliNC 101单一感染,然后分别在感染前(0d),感染后4d、7d和30d,分离小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞(MLN),应用E.coli NC 101细菌裂解液10 μg/mL刺激MLN, ELISA检测IFN-γ的分泌量;同时分离脾脏淋巴细胞,应用E.coli NC 101细菌裂解液10 μg/mL刺激未分离的淋巴细胞,ELISA检测促炎性细胞因子IFN-γ和IL-17的分泌量,以及结肠组织培养自发分泌产生的IL-12/23p40的水平。接着在129野生型小鼠单一感染E.coliNC 101前,感染后4 d、7 d、14 d和30 d,分离小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞,应用10 μg/mL和1 μg/mL的E.coli NC 101细菌裂解液刺激MLN,ELISA检测IFN-y和IL-10的分泌量;并检测远端盲肠中IFN-y和IL-10 mRNA的表达。为了进一步研究IL-10对免疫细胞的调节作用,单一感染E.coli NC 101后4 d,在MLN培养时分别加入浓度为250 pg/mL、500 pg/mL、1000 pg/mL和2000 pg/mL的IL-10重组蛋白,检测IL-10重组蛋白对MLN分泌IFN-y的影响;并在单一感染E.coliNC 101后7 d和14 d,通过在MLN培养时体外添加IL-10受体单克隆抗体阻断IL-10信号传导通路,检测其对MLN分泌IFN-γ的影响;同时进行体内阻断IL-10信号传导通路,ELISA检测MLN分泌IFN-y和IL-10的水平,及远端盲肠中IFN-y和IL-10 mRNA的表达。结果显示:在单一感染的条件下,肠道共生菌E.coliNC 101能够激活129品系小鼠的肠道黏膜免疫应答。野生型小鼠在单一感染4 d时,IFN-y在MLN和盲肠中的分泌与基因表达均达到最高水平,随后显著降低;IL-10基因敲除小鼠在感染后的各个时间点均分泌大量IFN-γ。IFN-y和IL-10 mRNA在盲肠中的表达与其在MLN中分泌水平的变化趋势相同。体外添加IL-10重组蛋白可以降低IFN-γ在MLN中的分泌水平,体内和体外阻断IL-10信号传导通路可以增加IFN-γ在MLN中的分泌水平。由此得出,单一感染肠道共生菌E.coli NC 101的129小鼠在感染早期即可产生大量促炎症细胞因子IFN-y;单一感染刺激机体产生的IL-10,通过下调IFN-γ的分泌与表达,参与调节E. coli NC 101对肠道黏膜的免疫应答。试验Ⅱ单一感染E.coli NC 101诱导C57B6 IL-10基因敲除小鼠产生的免疫反应研究应用C57B6IL-10基因敲除小鼠,每只小鼠通过灌胃给予0.2mL菌液(OD600 =0.9-1.0),研究单一感染E.coli NC 101对C57B6 IL-10基因敲除小鼠机体免疫反应的影响。本试验在感染前(0d),感染后5 w、10 w、11 w和12 w分别进行组织学检查,检测单一感染是否对C57B6 IL-10基因敲除小鼠造成肠道损伤;同时检测了未分离的脾脏淋巴细胞、肠系膜淋巴结淋巴细胞(MLN)在10 μg/mL、1 μg/mL、0.1μg/mL的E.coli NC 101细菌裂解液刺激下,炎性细胞因子的分泌量以及结肠组织培养自发分泌IL-12/23p40的水平;并通过CD4…+ T细胞和抗原递呈细胞APC共培养,检测单一感染对C57B6 IL-10基因敲除小鼠肠道黏膜局部T细胞活化的影响。结果显示:在单一感染后5 w、10 w、11 w和12 w肠道组织学切片可见轻度的病理变化;肠组织培养自发分泌的IL-12/23p40在感染后各时间点与感染前相比差异显著;单一感染后5 w、10 w、11 w和12 w,小鼠脾脏淋巴细胞,在不同浓度E.coli NC 101细菌裂解液的刺激下,分泌的IFN-γ均显著高于感染前,单一感染后各时间点MLN在E.coli NC 101细菌裂解液的刺激下分泌产生大量的IFN-γ和IL-17,且各时间点分泌量均显著高于感染前的水平。本试验结果表明:在单一感染的条件下,E.coli NC 101可以激活C57B6 IL-10基因敲除小鼠的肠道黏膜和全身性免疫应答,并对肠道组织造成轻度的病理变化。单一感染E. coli NC 101后,结肠自发分泌的IL-12/23p40、脾脏淋巴细胞分泌的IFN-γ、APC和CD4+ T细胞共培养分泌的IFN-γ和IL-17显著高于感染前。试验Ⅲ ATG16L1、MyD88和NOD2基因调节细胞抗原递呈功能的比较研究本试验分别应用C57B6背景的ATG16L1超等位基因小鼠、MyD88基因敲除小鼠和NOD2基因敲除小鼠,比较ATG16L1、MyD88和NOD2三种基因对抗原递呈功能的影响。试验分三个部分:(1)应用条件致病性肠道共生菌E.coliNC 101和非致病性肠道共生菌E.coliK12研究不同基因来源的脾脏巨噬细胞对活细菌的吞噬作用,及活细菌在巨噬细胞内24h和48h的存活情况及存活率。研究结果显示:E.coliNC 101在ATG16L1超等位基因小鼠和MyD88基因敲除小鼠脾脏巨噬细胞内的存活率与E.coi K12相比,存在显著差异;而在NOD2基因敲除小鼠中则没有差异;与野生型小鼠相比,E.coliNC 101在ATG16L1超等位基因小鼠脾脏巨噬细胞内的存活率显著高于其在野生型小鼠的存活率。(2)分离E.coliNC 101单一感染的C57B6IL-10基因敲除小鼠肠系膜淋巴结的CD4+T细胞,并将上述三种不同基因小鼠脾脏抗原递呈细胞APC与CD4+ T细胞共培养,通过ELISA检测其分泌产生的IFN-γ和IL-17含量,来比较这些基因工程小鼠抗原递呈功能与野生型小鼠的异同。结果显示:三种不同基因来源的脾脏APC和CD4+T细胞共培养分泌产生的IFN-γ和IL-17与野生型小鼠相比,没有显著差异。(3)基于上述试验结果,选取骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和树突状细胞(BMDC),进一步研究ATG16L1超等位基因小鼠与野生型小鼠抗原递呈功能的异同。分别用活细菌E. coliNC 101刺激2.5×105个细胞/孔、5.0×105个细胞/孔、7.5×105个细胞/孔和10.0×105个细胞/孔的BMDM,以及2.5×105个细胞/孔和5.0×105个细胞/孔的BMDC,通过ELISA检测不同培养时间细胞分泌的炎性细胞因子IL-10、IL-12和TNF-α的水平。研究结果表明:BMDM在活细菌E.coli NC 101的刺激下分泌产生大量的IL-10;其中,来源于ATG16L1超等位基因小鼠的BMDM分泌产生的IL-10在各时间点均大于野生型,培养8h时各细胞浓度的分泌量均差异显著;IL-12的分泌量在各时间点均小于野生型,培养12 h时各细胞浓度的分泌量均差异显著;而TNF-α的分泌量只有当细胞量为10.0×l05个/孔,培养6h时,显著高于野生型小鼠的分泌量。BMDC在活细菌E. coli NC101的刺激下分泌产生大量IL-12;培养8 h时来源于ATG16L1超等位基因小鼠的BMDC分泌产生的IL-12显著低于野生型,而IL-10和TNF-α的分泌量则与野生型小鼠没有差异。以上试验结果表明:ATG16L1基因功能损伤,可以增加细菌在巨噬细胞中的存活率,促进巨噬细胞和树突状细胞活化,分泌细胞因子IL-10和IL-12。试验Ⅳ苦参碱对IL-10基因敲除小鼠自发性肠炎的治疗作用及其黏膜免疫机制研究本研究应用SPF级别129 SvEv品系IL-10基因敲除小鼠,探讨苦参碱是否可以减轻自发性肠炎的症状及其黏膜免疫机制。自发产生肠炎的IL-10基因敲除小鼠,每天灌胃给予浓度为10 mg/kg苦参碱,对照组灌胃给予PBS对照,持续4 w,每周检测小鼠体重变化。小鼠分别在2 w和4 w处死,测量小鼠体重、结肠长度、结肠重量、组织学炎症评分;检测结肠自发分泌的IL-12/23p40、IFN-y和IL-17的分泌量;肠系膜淋巴细胞在盲肠菌群裂解物刺激后IFN-y和IL-17的分泌量;以及远端结肠中IFN-γ、IL-17,IL-lβ和IL-6mRNA的表达。此外,应用流式细胞仪检测了肠系膜T淋巴细胞中CD4+和CD8+细胞所占比例。结果显示:苦参碱组小鼠的体重逐渐恢复,肠道组织学炎症评分和结肠组织培养自发分泌的IL-12/23p40、IFN-y和IL-17量显著低于对照组小鼠。苦参碱组小鼠肠系膜淋巴细胞中CD4+所占比例显著低于对照组。此外,苦参碱组小鼠IFN-y和IL-17在结肠组织中的mRNA表达显著低于对照组。本试验结果表明:苦参碱对于IL-10基因敲除小鼠自发性肠炎有良好的治疗作用,苦参碱通过调整机体肠道黏膜免疫应答反应,发挥其治疗作用。