与其它报道的产紫杉醇内共生真菌不同,本实验室从废纸中分离筛选到一株腐生真菌NK-17,其发酵产物经过TLC法初步鉴定,与紫杉醇标准品具有相同的迁移率(Rf值);经HPLC定性定量检测,与紫杉醇标准品具有相同的保留时间；经质谱进一步确定,与紫杉醇标准品具有相同的分子量；经核磁共振确定其与紫杉醇标准品具有相同的分子空间结构；另外检测到终端腐霉(Pythiumultimum)生长受发酵样品的抑制形成抑菌圈,证实了此菌的发酵产物中确实含有紫杉醇,并且此紫杉醇具有生物学活性。 其后对该菌进行的包括菌落形态学和18S rDNA在内的分类学鉴定,证实此菌为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis),命名其为Pestalotiopsis sp. NK-17。 为了便于在P.sp.NK-17中进行基因操作,我们首次建立了这种菌的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的高效转化体系。首先将携带构巢曲霉色氨酸合成基因(trpC)的启动子的潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)的二元载体,用CaCl2法转化根癌农杆菌LBA4404,然后将此重组根癌农杆菌与P.sp.NK17的孢子在24℃下共培养48h,转化效率高达200-300个转化子/107个孢子,筛选标记是潮霉素抗性基因。Southern blot结果表明66％的转化子含有T-DNA的单拷贝随机插入片段,为后续DNA的分析提供了方便。 我们对根癌农杆菌介导的丝状真菌的最佳转化条件进行了摸索,在根癌农杆菌预培养时加入乙酰丁香酮(AS),能够明显提高转化效率。随机挑选2个转化子进行遗传稳定性测试,在没有选择压力的培养基上连续培养5代,转化子仍然保持对潮霉素的抗性,Southern blot结果也表明T-DNA的拷贝数目前后没有发生任何变化。 相对于传统的丝状真菌转化方法,根癌农杆菌介导的丝状真菌的转化体系以其高效和菌株出发材料的广泛选择范围为特点,在产紫杉醇真菌的遗传转化和随机突变等领域展示出了巨大潜力。