精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是具有自我更新的能力,在体内是单能干细胞,体外经退分化诱导可以成为多能干细胞。可以在自身基因和/或外来信号调节下最终分化为成熟精子,对精原干细胞的研究近年来倍受关注。精子发生的分子机制是当前精原干细胞研究的热点。也是这个领域最具研究价值的课题之一。目前对于精原干细胞早期分化的分子机制的研究大多集中于小鼠和果蝇等动物。大鼠的报道相对较少,睾丸是精子发生的场所,精子发生是一个复杂而又规律的细胞分化过程,生精细胞的发育需要严格的特殊环境,从精原细胞的分裂增殖、精母细胞的减数分裂到精子细胞变态分化和运行至附睾的成熟过程中,都受到众多基因和激素的协同调控。研究精子发生分子机制不仅要考虑到精原细胞本身的基因表达,还要考虑周围环境对精原细胞分化的影响。为此,本研究主要以睾丸为研究对象,从大鼠出生第2天至第30天,研究精子发生早期相关的关键基因的表达模式。为进一步发现新的关键基因以及揭开精子发生的分子机制提供实验依据。1.大鼠睾丸组织共培养体系精子发生相关基因的转录表达本实验对15日龄的大鼠睾丸生殖细胞进行曲细精管生殖细胞体外共培养。对体外长期培养过程中对各级生殖细胞进行形态学观察,采用RT-PCR法对大鼠生殖细胞共培养体系在体外培养1个月、1.5个月、2个月和2.5个月的各级生殖细胞的标记基因：A型精原干细胞的标记基因E型钙粘连蛋白基因(E-cadherin,CDH1)；精母细胞的标记基因联会复合体蛋白3基因(synaptonemal complex protein-3, SYCP3);圆形精子细胞的标记基因过渡蛋白2基因(Transition protein-2, TP2);内参基因,3-磷酸甘油酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)进行基因的转录表达分析。结果显示：大鼠生殖细胞及支持细胞在该共培养体系中可长期共生,在共培养体系中除能观察到大量的支持细胞外,主要的是精母细胞和圆形精子细胞；在两个月以后仍能看到大量的精母细胞与精子细胞在支持细胞上共生的现象,说明在此期间共培养体系中存在精原干细胞的自我更新与分化；在体外共培养体系中,1个月至2.5个月细胞样品中均检测到了CDH1基因、SYCP3基因和TP2基因的转录表达,从分子水平上确定该体外共培养体系中存在着精子发生过程中的各级生殖细胞。大鼠生精细胞的RT-PCR检测有望从分子水平上初步建立大鼠睾丸生殖细胞体外培养的鉴定方法,为精子发生过程的研究提供细胞模型,为进一步研究精原干细胞体外长期培养过程中增殖和分化的分子机理奠定基础。2.大鼠青春期前期睾丸组织中精原干细胞增殖与分化相关基因的转录水平表达本研究选择大鼠青春期前期,这是精原干细胞发生、增殖、进入减数分裂进而产生单倍体配子精子发生的关键时期,取出生后第2,4,6,8,10,12,15,20,25,30天睾丸组织为研究对象,通过RT-PCR检测SYCP3,和TP2转录水平的表达,通过RT-PCR半定量的方法,检测CDH1,GFRa-1, C-kit, SCF, GDNF转录水平的表达,可以看出大鼠出生第8天是SSCs发育的关键时期。在第8天,原生殖细胞和生殖母细胞分化成为精原干细胞,并且进一步分化进入A型精原细胞。从第8天到第15天,一方面自我更新,另一方面继续分化。到第15天,SSCs进入减数分裂产生初级精母细胞,15天以后,SSCs自我更新和分化趋于动态平衡,到第30天,SSCs分化产生圆形精子。在大鼠青春期前期,这些关键基因独特的时空表达模式对于精原干细胞自我更新和分化都至关重要。3.大鼠精子发生早期睾丸组织基因差异表达分析本研究根据精子发生早期睾丸特异表达的关键基因CDHl,GDNF, GFRα-1,SCF(?)和C-KIT的转录表达模式,在大鼠出生第6天至第10天期间,这些基因的mRNA水平呈现显著的变化,可以看出大鼠出生第8天是SSCs发育的关键时期。因此,取出生后第6,8,10天的睾丸组织,通过高通量的全基因组表达谱芯片技术分析比较了大鼠出生后第6天,第8天,第10天的基因表达模式。比较这三个时间点睾丸组织差异表达的基因。结果显示：在全基因组表达谱芯片涵盖的26419个基因中,这三个时间点睾丸组织差异表达的基因,差异倍数在2倍以上的基因有700-4519个之间,包括表达上调的基因和表达下调的基因,参与的生物学通路有46-154个之间,具有620-3237个基因本体注释。一些差异表达显著的基因通过荧光定量PCR做了进一步的验证。基因芯片的结果至少可以得到以下结论：第一,大鼠青春期前睾丸发育过程中,出生后第6天至第10天是精子发生非常关键的时期；第二,早期精子发生是非常复杂而高度有序的过程,通过数以千计的基因编码产物蛋白质在生殖细胞早期发育过程中起重要作用的蛋白质而起作用；第三,大鼠早期精子发生的每一个程序都是多基因参与的过程。4.Trib3,Cxc16,C2cd4d基因在睾丸组织中的表达在基因芯片分析结果的基础上,我们选出差异表达异常显著的3个基因,C2cd4d,Cxc16和Trib3。分别通过荧光定量PCR和免疫荧光染色的方法,检测了C2cd4d,Cxc16,Trib3基因在大鼠青春期前期睾丸组织中的转录水平；通过免疫荧光染色分析确定了CXCL6和TRIB3蛋白产物的表达定位,从而揭示这两个基因的表达产物可能与大鼠睾丸组织早期发育以及大鼠青春期前期精原干细胞自我更新和分化相关。结果显示：C2cd4d,Cxc16和Trib3基因在大鼠青春期前期睾丸组织中的转录水平具有明显动态变化。C2cd4d的表达呈现波浪形,在大鼠出生后第4天,达到第一次高峰,随后下降,第8天达到第二次高峰,随后又下降,到第12天达到第三次高峰,而且是最高峰。随后缓慢下降,第20天下降到底端,从第25天又开始缓慢抬高。Trib3在出生第2天表达最强,随后迅速下降,第4天至第8天基本稳定在一个平台期,第8天之后又开始增强至第10天出现一个小的峰值,之后又缓慢下降。Cxcl6水平从出生第2天开始缓慢下降,到第10天达到最低值,一直持续到第20天,从第20天开始迅速线性上升。免疫荧光染色结果,从形态上看,TRIB3是表达于精原干细胞中,暗示这个基因的表达与精原干细胞的功能相关。CXCL6(GCP-2)的表达部位与顶体十分相似,CXCL6也极有可能参与顶体的发生及顶体反应。当然这还需要以后做大量的工作进一步验证。这些结果都将为我们下一步研究精子发生的分子机制提供了新的思路和信息。