氨肽酶N(Aminopeptidase N, APN)是属于锌离子依赖性金属蛋白酶的一类膜结合型外肽酶,以同源二聚体结构存在于细胞膜。APN广泛存在于大脑、肾、肝脏、胎盘和子宫等。与正常细胞相比,APN在癌细胞表面高水平表达,对肿瘤细胞的侵袭、转移和肿瘤新血管的形成起着重要的作用,被称为肿瘤细胞表面相关抗原CD13。近年来,以APN为靶点的肿瘤治疗策略迅速发展起来,APN抑制剂已经成为抗癌药物研究的热点课题。因此,发展和建立快速、可靠及高通量APN抑制剂筛选方法对于研发新药物具有十分重要的现实意义。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)具有样品消耗量少、分离效率高、分析时间短及自动化程度高等优点,被广泛应用于酶反应的测定中,成为了酶活性及酶抑制剂筛选研究常使用的分析手段。电泳调控微分析法(Electrophoretically Mediated Microanalysis, EMMA)是以毛细管电泳柱进样端约1.5～2.0 cm部分作为反应的微室,将酶溶液和底物溶液依次进样到毛细管中,接着施加一段时间小电压让酶和底物溶液在毛细管中充分混合并反应,当酶促反应进行完毕后,加一高电压对酶促反应生成的产物和未反应的底物进行分离,随后进行检测。该法在同一根毛细管内集成了混合、反应、分离及检测的全过程。本课题建立了APN抑制剂的毛细管电泳在线筛选方法,为抗肿瘤药物的研究开发提供了新的筛选模型。主要研究工作和成果如下：1.本文建立了APN抑制剂EMMA筛选方法,并将该法应用于APN抑制剂的活性筛选研究中。电泳条件采用熔融石英毛细管(内径75μm,有效长度为50cm),柱温37℃,分离体系30 mM HEPES缓冲溶液含40 mM脱氧胆酸钠(pH7.7),分离电压25 kV,二极管阵列检测器(DAD)检测波长为380 nm。EMMA法中,孵育缓冲溶液(50 mM磷酸盐缓冲溶液,pH 7.7)、APN溶液、底物溶液(含内标)及孵育缓冲溶液液依次在0.5 psi压力下分别进样10 s,在±2.0 kV各加压6s使酶和底物混合,在+1.0 kV电压,孵育2 min后,在毛细管两端加25 kV电压,经酶解后生成的产物、内标与未完全反应剩余的底物,在电渗作用下进入毛细管分离区,依据各自迁移速率的不同而实现电泳分离。利用建立的方法测定了氨肽酶N的动力学参数(Km和Vmax)发现测得的动力学参数值与文献报道值一致,以此证明在该模型中酶的活性保持良好。以乌苯美司为阳性对照,用所建立的方法制作量-效曲线同时测定其IC50,与文献报道的酶标法测定值比较,验证了筛选方法的可行性。最后采用EMMA氨肽酶N抑制剂筛选方法从山东大学药学院药物化学研究所提供的以APN为靶点合成的29个合成新化合物(包括2个化合物粗合成物,含量约50%)进行APN抑制剂的筛选研究。2.通过细胞膜制备技术得到高表达APN的人卵巢透明细胞癌细胞(ES-2)的细胞膜,测定细胞膜蛋白质含量和膜APN活性对其进行表征后,将活性细胞膜填充至毛细管进样端形成酶促反应微室,毛细管剩余部分作为酶促反应产物和未反应完的底物的分离通道,建立了APN抑制剂的细胞膜毛细管电泳筛选方法。乌苯美司作为阳性抑制剂,用所建立的方法制作量-效曲线同时测得乌苯美司的半抑制剂浓度IC50值为19.3μM,与文献报道的乌苯美司的IC50值(20.5μM)结果一致。顺铂为阴性抑制剂并选择以低表达APN的人慢性髓系白血病细胞(K562)的细胞膜作阴性对照实验,验证了筛选方法的可行性。利用建立的细胞膜毛细管电泳法测定了细胞膜上APN的酶促动力学参数(Km)发现测得的细胞膜上APN的米氏常数(Km=0.82 mM)大于游离APN米氏常数(Km=0.34 mM),表明细胞膜上的APN与底物亲和力小于游离形式存在的APN与底物的亲和力。最后采用细胞膜毛细管电泳筛选方法对合成的新化合物进行APN抑制剂的筛选研究。