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背景脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点。我国每年有超过200万的新发脑卒中患者,每年死于脑卒中的人数超过150万,脑卒中的发病率和死亡率均位居第一。我国的流行病学调查结果显示,缺血性卒中占脑卒中的66.4%,具有更为重要的临床意义。缺血性脑卒中发生后,由于缺血区局部脑组织缺血缺氧,造成大量神经细胞严重损伤,并最终导致细胞死亡。因此,再灌注是治疗缺血性脑卒中最基本、最重要的原则,但恢复血液供应后又会发生再灌注损伤,反而加重脑组织损伤。再灌注会在缺血性损伤的基础上引起脑组织的二次损伤,严重影响患者的预后。随着缺血性脑卒中的发病率不断攀升,以及诊疗水平的提高,接受再灌注治疗的缺血性脑卒中患者将越来越多,而脑缺血再灌注损伤也将越来越常见。因此,防治脑缺血再灌注损伤非常重要。鉴于脑卒中的治疗目标是保护神经细胞,减少神经细胞的死亡。因而,神经保护治疗可用于防治脑缺血再灌注损伤。但现有的神经保护治疗措施并没有达到预期的效果。因此,研究脑缺血再灌注损伤引起神经细胞死亡的分子生物学机制,寻找缺血性脑卒中治疗的新靶点具有十分重要的意义。干扰素调节因子家族(Interferon regulatory factor family, IRF family)在哺乳动物体内有9个家族成员。干扰素调节因子4(Interferon regulatory factor 4, IRF4),是其中的一个重要成员。IRF4的氨基端有一个DNA结合域(DNA-binding domain,DBD)具有高度保守性,羧基端有有一个调节域(regulatory domain, RD)叫做IRF相关结构域1 (IRF-associated domain 1,IAD1)能够调节IRF4的转录活性,并介导IRF4与与其他转录因子的相互作用(包括其他IRF家族成员)。这两个结构域使IRF4能够作为转录激活/抑制因子发挥生物学作用。IRF4作为重要的转录因子参与多种病理生理过程。IRF4能够调控天然免疫和获得性免疫反应,调节B细胞、T细胞和树突状细胞的分化和成熟,参与自身免疫性疾病和血液系统恶性肿瘤等疾病的发生发展。新的研究发现IRF4能够调节脂肪代谢,参与调节压力负荷过重引起的心肌肥厚,更有意义的是IRF4在肾缺血再灌注损伤中的重要作用也得到了证实。我们在小鼠脑组织中检测到由神经细胞表达的IRF4,并且观察到脑缺血再灌注损伤后IRF4的表达显著升高,因此,IRF4极有可能在脑缺血再灌注损伤过程中也发挥重要作用。本研究通过线栓法暂时闭塞大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion, MCAO)建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型,并运用神经元特异性IRF4基因敲除和转基因小鼠探究IRF4在脑缺血再灌注损伤中的作用,并应用分子生物学技术深入探讨,阐明其分子机制。目的阐明IRF4在脑缺血再灌注损伤中的作用,探讨其分子生物学机制,为临床寻找新的治疗靶点。方法第一部分：选取雄性C57BL/6小鼠用线栓法暂时闭塞左侧大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion, MCAO)构建脑缺血再灌注损伤模型。小鼠的周龄为11-12w,体重25-30g,缺血时间为45min。分别取术前、术后2h、6h、12h、24h、72h的脑组织检测IRF4蛋白的表达情况。体外实验用出生1 d的SD大鼠脑组织培养原代神经细胞,经过糖氧剥夺(Oxygen-Glucose Deprivation, OGD)处理(60 min),取处理前、处理后3 h、6h、12 h、24 h的细胞检测IRF4的表达情况。检测方法为Western Blot和免疫荧光染色。第二部分：用IRF4flox/flox小鼠与CaMKIIa-Cre小鼠杂交获得神经细胞特异性IRF4基因敲除小鼠(IRF4-KO)。选取雄性WT(CaMKIIa-Cre)和IRF4-KO小鼠(11-12w,25-30g),将它们随机分入假手术组(Sham组)和MCAO组。通过神经功能评分、TTC(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride)染色和MRI(Magnetic Resonance Imaging)对损伤程度进行评估；通过免疫荧光染色和Western Blot检测与脑缺血再灌注损伤后凋亡相关指标。体外实验用腺病毒介导的IRF4基因敲低(AdshIRF4)原代神经细胞及其对照组(AdshRNA)进行验证,检测细胞活力和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)释放情况。第三部分：将小鼠IRF4 cDNA插入到CAG-loxp-CAT-loxp结构中,通过显微注射法获得IRF4-floxed小鼠,将其与CaMKIIa-Cre小鼠杂交获得神经细胞特异性IRF4转基因小鼠(IRF4-TG)。将NTG(CaMKIIa-Cre)和IRF4-TG小鼠分别随机分入假手术组和MCAO组。通过神经功能评分、TTC(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride)染色和MRI(Magnetic Resonance Imaging)对损伤程度进行评估；通过免疫荧光染色和Western Blot检测相关指标。体外实验用腺病毒介导的IRF4基因过表达(AdIRF4)原代神经细胞及其对照组(AdGFP)进行验证。第四部分：用转录组测序(RNA-seq)技术检测MCAO术后WY和IRF4-KO小鼠基因表达情况,筛选出由IRF4敲除引起表达发生改变的基因,推测受IRF4调控的下游信号通路,并用RT-PCR和Western Blot实验验证。用双荧光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)分别检测AdshIRF4、AdIRF4及其对照组经OGD处理后的SRF启动子活性,用(mutant murine SRF promoter,MumSRF-Luc)确定SRF启动子上存在IRF4结合位点；并通过染色质免疫共沉淀法(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)定位SRF启动子上的IRF4直接结合位点。第五部分：构建腺病毒介导的SRF基因过表达(AdSRF), SRF基因敲低(AdshSRF),敲低IRF4同时过表达SRF (AdshIRF4+AdSRF)和过表达IRF4同时敲低SRF(AdIRF4+AdshSRF)的原代神经细胞,同对照组一起经OGD处理之后,检测相关指标。用SRFflox/flox小鼠与CaMKIIa-Cre小鼠杂交获得神经细胞特异性血清反应因子(Serum response factor, SRF)基因敲除小鼠(SRF-KO);通过IRF4-TG小鼠和SRF-KO杂交获得同时具备IRF4转基因和SRF基因敲除特性的小鼠(IRF4-TG/SRF-KO).分组后建立脑缺血再灌注损伤模型。通过TTC(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride)染色和神经功能评分对损伤程度进行评估；通过免疫荧光染色和Western Blot检测相关指标,用动物实验对细胞实验结果进行验证。结果第一部分：体内和体外实验结果显示脑缺血再灌注损伤后IRF4的表达升高。小鼠经过MCAO处理45 min后,再灌注2 h-72 h,损伤侧IRF4的表达随时间延长而递增。免疫荧光染色结果显示损伤侧皮层和纹状体的神经细胞IRF4表达明显升高,而海马区IRF4的表达未见明显变化；原代神经细胞经OGD处理后,同样检测到神经细胞IRF4表达升高。第二部分：神经细胞特异性敲除IRF4显著加重脑缺血再灌注损伤。 WT和IRF4-KO小鼠经过MCAO处理45 min,在24 h和72 h两个时间点分别对小鼠进行神经功能评分,取脑组织,切片进行TTC染色。和WT组小鼠相比,IRF4-KO组小鼠神经功能评分升高了约57.14%(24h)和49.33%(72h),P<0.05; IRF4-KO组的脑梗死体积增大了约74.27%(24h)和48.40%(72h),P<0.05。MRI结果也显示IRF4-KO小鼠脑梗死体积比WT组增加了1.7倍(P<0.05)。IRF4-KO组小鼠Fluoro Jade B和Tunel阳性细胞数明显增加,促凋亡的Bax和Cleaved-casp3表达增高,抗凋亡的Bcl2表达明显降低。体外实验部分,同对照组相比AdshIRF4组的原代神经元经OGD处理后细胞活力明显降低,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放增加(P<0.05)。第三部分：神经细胞特异性IRF4过表达对脑缺血再灌注损伤具有明显保护作用。MCAO术后,IRF4-TG组小鼠的神经功能评分比NTG组降低了约38.10%(24h)和41.18%(72 h),梗死体积减小了约52.71%(24 h)和69.36%(72 h),P’<0.05。MRI结果也证实IRF4-TG小鼠脑梗死体积明显减小(P<0.05)。IRF4-TG组小鼠Fluoro Jade B和Tunel阳性细胞数明显减少,Bax、Cleaved-casp3表达降低,Bcl2表达明显升高。体外实验证实,与对照组相比AdIRF4组的原代神经元经OGD处理后细胞活力明显升高,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放减少(P<0.05)。第四部分：脑缺血再灌注损伤后,IRF4通过SRF发挥保护作用。RNA-seq测序的结果显示, IRF4-KO小鼠SRF及其下游蛋白BDNF、FosB和Egrl等的nRNA表达水平均明显降低(P<0.05)。IRF4-KO小鼠上述蛋白表达水平也明显下降,IRF4-TG小鼠表达则明显增高(P<0.05)。经OGD处理后,转染AdshIRF4的原代神经细胞SRF启动子转录活性降低,而转染AdIRF4后其转录活性增强(P<0.05)。突变型SRF启动子使AdIRF4组SRF启动子荧光素酶活性降到与AdGFP组同一水平。ChIP结果显示,IRF4通过识别并结合SRF启动子上P3段的5’-GAAA-3’序列激活其转录活性,并且IRF4与该位点的结合是直接的。第五部分：IRF4的神经保护作用依赖SRF。经OGD处理后, 转染AdSRF组细胞活力明显升高、AdSRF逆转AdshIRF4引起的细胞活力降低,AdSRF组与AdshIRF4+AdSRF组的细胞活力及乳酸脱氢酶释放定量值没有统计学差异(P>0.05); AdIRF4的保护作用被AdshSRF逆转,AdshSRF组与AdIRF4+AdshSRF组的上述定量结果没有统计学差异(P>0.05)；小鼠神经细胞特异性敲除SRF后逆转IRF4的保护作用,显著加脑缺血再灌注损伤重。SRF-KO小鼠的神经功能评分更高,梗死体积显著增大。IRF4-TG/SRF-KO组SRF敲除逆转IRF4的保护作用,该组小鼠的神经功能评分和梗死体积大小与SRF-KO组小鼠接近,两组间没有统计学差异(P>0.05)。结论1.脑缺血再灌注损伤后,小鼠损伤侧脑组织IRF4表达水平显著升高,主要由损伤部位的神经细胞表达。2.IRF4具有神经保护作用,IRF4过表达抑制脑缺血再灌注引起的神经细胞死亡,使梗死体积缩小,而IR4敲除则逆转这一保护作用。3.IRF4的神经保护作用依赖SRF,并通过激活SRF及其下游蛋白质分子保护神经细胞；敲除SRF后IRF4的保护作用被逆转,SRF是IRF4发挥保护作用的关键。