论文部分内容阅读
目的:在实体瘤中,肿瘤微环境分泌的细胞因子可募集血液循环中的单核细胞到达肿瘤部位,诱导其激活分化为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)在早期发挥抗肿瘤作用,而到肿瘤的后期则发挥着促进肿瘤发展作用。由于巨噬细胞的可塑性,长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)可潜在调控巨噬细胞表型改变,进而促进其发挥抗瘤作用而抑制其免疫抑制作用。本论文初步探讨lincRNA-p21对肿瘤相关巨噬细胞表型转换的调控,并研究其潜在的调节机制,为临床肿瘤的诊疗提供新的靶点。方法:(1)选取自发乳腺癌小鼠的乳腺组织,采用免疫组化的方法检测巨噬细胞在乳腺肿瘤组织中的浸润情况。收集正常培养的RAW264.7和4T1肿瘤上清刺激过的RAW264.7进行lncRNA表达芯片的检测及后续的高级分析(委托上海欧易医学生物科技有限公司),筛选差异明显的lncRNA采用荧光实时定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)进行验证,选取表达量高、表达稳定的lncRNA作为研究对象。此外,收集小鼠肿瘤细胞CT26和Lewis的培养上清刺激巨噬细胞RT-qPCR检测lincRNA-p21的表达情况。设计小鼠lincRNA-p21特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)(si-lincRNA-p21),并用RT-qPCR和带荧光标记的si-lincRNA-p21验证其干扰效果及干扰效率。(2)确定lincRNA-p21的抑制对4T1肿瘤上清刺激的巨噬细胞自身的影响,采用CCK-8试剂盒检测巨噬细胞增殖情况;利用Annexin-V/PI试剂盒检测巨噬细胞凋亡情况;采用酶联免疫吸附技术(ELISA)检测巨噬细胞分泌IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的情况;利用流式细胞术(FCM)检测巨噬细胞表面标记CD80、CD86、CD206及MHCⅡ的表达情况;利用Western-blot测定巨噬细胞中精氨酸酶-1(Arg-1)、一氧化氮合酶(iNOS)的表达;利用大肠杆菌标准菌株检测巨噬细胞的吞噬功能。(3)研究低表达lincRNA-p21的巨噬细胞与4T1肿瘤细胞共培养后对肿瘤细胞的影响,si-lincRNA-p21转染巨噬细胞后与肿瘤细胞共培养,采用CCK-8试剂盒检测肿瘤细胞增殖情况;利用Annexin-V/PI试剂盒检测肿瘤细胞凋亡情况;利用Transwell小室检测肿瘤细胞的迁移能力;利用划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力;FCM检测巨噬细胞表面FasL的表达及肿瘤细胞表面Fas的表达。(4)采用小鼠脾脏单核细胞分离试剂盒分离正常小鼠脾脏单核细胞,流式细胞分选仪分选荷瘤小鼠肿瘤组织中浸润的巨噬细胞,RT-qPCR检测原代细胞中lincRNA-p21的表达情况。用1×10~6个si-lincRNA-p21转染巨噬细胞混合等量的4T1肿瘤细胞皮下注射BALB/c小鼠,每7天在同一位置注射1×10~6个si-lincRNA-p21转染的巨噬细胞,连续监测小鼠皮下瘤生长情况和小鼠生存情况,实验结束处死小鼠后称量小鼠肿瘤质量。为了探讨lincRNA-p21调控巨噬细胞发生表型转换的潜在机制,利用Western-blot测定lincRNA-p21调控的下游基因Bax和Bcl-2及与lincRNA-p21相互作用的蛋白p53和MDM2的表达情况;采用FISH探针检测lincRNA-p21在巨噬细胞中的定位及与p53和MDM2相互结合的情况;Western-blot测定4T1肿瘤上清刺激敲低lincRNA-p21的巨噬细胞后STAT3和p65的磷酸化水平的表达。结果:(1)与正常巨噬细胞RAW264.7相比,4T1肿瘤上清刺激后RAW264.7中lincRNA-p21表达上调(p<0.05);CT26和Lewis肿瘤上清刺激RAW264.7后lincRNA-p21表达也上调(p<0.05)。(2)与NC组相比,CCK-8检测敲低lincRNA-p21的巨噬细胞增殖增加(p<0.05),凋亡减少;ELISA检测敲低lincRNA-p21的巨噬细胞分泌促炎因子IL-6、IL-12和TNF-α增多(p<0.05),抑炎因子IL-4减少(p<0.05);同时FCM结果显示与对照组相比,敲低lincRNA-p21的巨噬细胞表达CD206的比例降低,表达CD86的比例增加,而对巨噬细胞表达CD80和MHCⅡ没有显著影响。并且与NC组相比,lincRNA-p21敲低组巨噬细胞表达Arg-1减少,表达iNOS增多。同时lincRNA-p21的抑制对巨噬细胞吞噬功能也没有影响。(3)将巨噬细胞与4T1肿瘤细胞共培养后,CCK-8检测与敲减lincRNA-p21的巨噬细胞共培养后4T1肿瘤细胞增殖减缓(p<0.05),凋亡增多;与NC组相比,4T1肿瘤细胞与敲减lincRNA-p21的巨噬细胞共培养后迁移能力减弱(p<0.05)。同时FCM结果显示,巨噬细胞表面FasL和4T1肿瘤细胞表面Fas的表达并无明显改变。(4)分离原代单核细胞和肿瘤相关巨噬细胞,RT-qPCR检测lincRNA-p21的表达发现与细胞系结果一致,肿瘤组织中lincRNA-p21表达上调(p<0.05)。与对照组相比,注射转染si-lincRNA-p21巨噬细胞的小鼠肿瘤生长速度减缓(p<0.05),肿瘤质量减少(p<0.05),小鼠生存时间延长(p<0.05)。Western-blot结果显示,敲减lincRNA-p21可促进巨噬细胞Bcl-2的表达,抑制Bax的表达,同时对p53及MDM2无明显影响,并且4T1肿瘤上清刺激敲减lincRNA-p21的巨噬细胞24h时,STAT3和p65的磷酸化水平显著上调。FISH探针的结果显示,lincRNA-p21在巨噬细胞中主要定位于细胞胞浆内,且4T1肿瘤上清刺激后,lincRNA-p21与p53的结合显著增强,而与MDM2的结合较弱。结论:肿瘤相关巨噬细胞中lincRNA-p21表达上调,抑制lincRNA-p21的表达可促进巨噬细胞发挥抗肿瘤免疫。