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目的:敲减vps13d基因,观察匹罗卡品急性癫痫大鼠模型的行为学改变,检测敲减vps13d基因干预后对DRP1、LC3II及P62蛋白的表达影响,探索VPS13D是否通过调控线粒体分裂及自噬功能参与大鼠癫痫发作及其相关机制。方法:选取健康成年雄性SD大鼠,构建vps13d基因敲减慢病毒质粒、应用脑立体定位仪将慢病毒质粒定位注射到大鼠海马组织,建立vps13d基因敲减病毒大鼠模型,腹腔注射DRP1抑制剂Mdivi-1、构建DRP1抑制剂大鼠模型,干预处理后将所有大鼠全部诱发为匹罗卡品急性癫痫模型。随机分为6个组:正常对照组(n=8)、癫痫模型组(n=8)、vps13d基因敲减组(n=8)、空病毒组(n=8)、Mdivi-1组(n=8)、DMSO对照组(n=8)。急性癫痫模型建立成功后,观察大鼠首次癫痫发作的潜伏期时间,单位时间内大鼠癫痫发作(Racine评分4级及以上)的次数,统计分析并比较各组大鼠癫痫发作程度。通过HE染色法观察大鼠海马神经细胞的形态学变化,透射电镜观察大鼠海马线粒体超微结构的改变,免疫组化、免疫荧光检测VPS13D在正常对照及癫痫模型组大鼠海马组织的亚细胞定位及表达情况,免疫组化、Western Blot技术检测敲减vps13d基因干预对DRP1,LC3II及P62的表达影响。结果:1.HE染色观察正常对照及癫痫模型组大鼠脑海马组织的神经细胞形态学改变。结果显示:正常对照组大鼠海马组织CA1、CA3及DG区可见神经细胞分布均匀,形态规则,排列整齐;癫痫模型组大鼠海马组织CA1、CA3及DG区均可见细胞分布不均,形态不规则,排列紊乱,肿胀。2.免疫组化及免疫荧光检测VPS13D在正常对照及癫痫模型组大鼠脑组织的定位及表达情况。2.1免疫组化结果:VPS13D主要表达于大鼠海马组织神经元样细胞的胞浆,半定量分析结果显示:癫痫模型组VPS13D阳性细胞光密度值表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.2免疫荧光结果:VPS13D在大鼠海马CA1、CA3及皮质区均有表达,VPS13D与神经元树突标志物MAP2共表达,与胶质细胞标志物GFAP不表达;半定量分析结果显示:癫痫模型组VPS13D阳性细胞的荧光信号强度绝对值表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.行为学结果:正常对照组大鼠无癫痫发作,对其余各组大鼠首次癫痫发作的潜伏期时间进行统计分析,结果显示:vps13d基因敲减组大鼠癫痫发作的潜伏期时间明显缩短,Mdivi-1组大鼠癫痫发作的潜伏期时间显著延长,差异有统计学意义(P<0.05);对各组大鼠单位时间内癫痫发作的次数进行统计分析,结果显示:vps13d基因敲减组大鼠单位时间内癫痫发作的次数明显增加,Mdivi-1组大鼠单位时间内癫痫发作的次数显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4.线粒体超微结构的改变:透射电镜结果显示:正常对照组大鼠海马CA1区的线粒体结构完整,无线粒体膜及嵴损伤,未出现线粒体形态异常;癫痫模型组大鼠海马CA1区线粒体形态不规则,线粒体膜边缘损伤,部分线粒体嵴破坏,线粒体周边水肿明显,出现线粒体分裂以及线粒体自噬小体形成。5.Western blot检测敲减vps13d基因干预后对DRP1表达影响。结果显示在正常对照组大鼠海马组织的DRP1表达较低,癫痫模型组DRP1表达轻度增加,vps13d基因敲减组DRP1表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。6.自噬标记蛋白LC3II及自噬接头蛋白P62在各组大鼠海马组织的定位及定量表达情况。6.1免疫组化显示自噬标记蛋白LC3II及自噬接头蛋白P62大多数定位于大鼠海马神经细胞胞浆。6.2 Western Blot结果:正常对照组大鼠海马组织的LC3II表达较低,癫痫模型组LC3II表达轻度增加,差异有统计学意义(P<0.05);vps13d基因敲减组LC3II表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);Mdivi-1组LC3II表达轻度降低,与癫痫模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。正常对照组大鼠海马组织的P62表达较低,癫痫模型组P62表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);vps13d基因敲减组P62表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);Mdivi-1组P62表达轻度增加,与癫痫模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:VPS13D可能参与调控大鼠的癫痫发作,其机制可能与促进线粒体过度分裂,过度抑制线粒体自噬功能有关。