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目的:探索神经递质多巴胺(dopamine,DA)异常代谢生成的反应性氧化产物(Reactive oxidative products of dopamine,ROPD)共价修饰蛋白质在帕金森氏病(Pakinson’s disease,PD)发病进程中的作用。方法:首先将DA与加入了谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)及半胱氨酸(Cysteine,Cys)等亲核捕获剂、酪氨酸酶的0.1 M PBS或脑组织匀浆液中共孵育,通过高分辨质谱UPLC-Q/Orbitra MS监测ROPD-捕获剂共价结合物,筛查DA在体外研究体系中可形成的ROPD。然后,建立和优化蛋白酶解法及定量分析方法,将ROPD-蛋白结合物酶解为ROPD-氨基酸残基结合物,以筛查可共价修饰蛋白质的ROPD及定量其共价修饰能力。利用6-羟基多巴(6-hydroxydopa,6-OHDA)和鱼藤酮(Rotenone,ROT)制备PD模型大鼠,并通过Western blot和免疫荧光技术检测中脑黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)的表达,结合转棒实验验证PD大鼠模型的建立。采用蛋白酶解法处理PD模型大鼠脑组织样本,表征PD模型大鼠脑中的ROPD,并通过ROPD与合成肽段孵育验证ROPD表征结果。最后,在PD发生过程中的系列时间点收集PD模型大鼠纹状体和中脑黑质组织样本,通过LC-MS定量分析ROPD-氨基酸残基结合物水平以考察ROPD修饰纹状体和黑质区蛋白的经时过程。侧脑室注射ROPD,考察其共价修饰蛋白和对多巴胺能神经元的损伤作用。结果:在体外研究体系中,DA氧化生成的ROPD与捕获剂共价结合,发现4-S-NAC-5,6-di OH-indole,7-S-GSH-animochrome,2-S-Cys-DA等11个ROPD共价结合物,表明DA在体外体系氧化生成多巴胺邻醌(dopamine o-quinone,DAQ)、5,6-吲哚醌(5,6-indolequinone,DAQ)、氨基色素(aminochrome,AC)以及3,4-二羟基苯乙醛(3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyde,DOPAL)等ROPD。然后,本研究以京尼平(Genipin,GP)为工具化合物,建立和优化了蛋白酶解法。通过加入随行蛋白内标,提高定量方法准确性。在PD模型大鼠脑匀浆液中,发现DOPAL-Cys、7-S-Cys-aminochrome和7-S-GSH-aminochrome等游离结合物。通过蛋白酶解法处理PD模型大鼠脑组织,发现DOPAL-Lys、DOPAL-Lys(Cyclizing)、DOPAL-Gln、DOPAL-His以及7-N-Lys-aminochrome等5个氨基酸残基结合物。该结果表明在PD模型大鼠中,DA可氧化生成DOPAL和AC,这两个ROPD可与蛋白质含伯胺的氨基酸侧链通过席夫碱反应或亲核加成反应的方式共价修饰蛋白质伯胺。通过DOPAL分别与含Lys或Cys的合成肽段共孵育验证DOPAL蛋白结合能力及结构。在给予6-OHDA或ROT后的约10 min内,均发现DOPAL和AC可与PD模型大鼠脑内黑质和纹状体区域蛋白质发生共价结合,约在6 h达到峰值,与零点(Control)相比,各蛋白结合物的含量增加了约3-40倍。ROPD共价结合蛋白质远早于多巴胺能神经元的大面积丢失(12或24 h),因此ROPD共价修饰蛋白这一极早期事件可能是PD的公共事件。侧脑室立体定位注射DOPAL,可产生剂量依赖性的DOPAL-氨基酸残基结合物,注射给予DOPAL 24 h后多巴胺能神经元显著性丢失,表明DOPAL共价修饰蛋白可致多巴胺能神经元变性丢失。结论:在PD发病过程中,DA异常氧化产物DOPAL和AC通过席夫碱反应或亲核加成反应共价修饰黑质和纹状体部位含伯胺基团氨基酸侧链的蛋白质,该早期事件可能对PD发病进程发挥重要作用。本研究为PD发病机制及相关药物靶点研究提供了理论依据。