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目的:糖尿病心肌病是糖尿病患者的主要心血管并发症之一。脂肪酸代谢紊乱是糖尿病心肌病变的一个重要影响因素。对糖尿病心肌脂肪酸代谢相关酶的基因表达变化进行研究,有助于对糖尿病心肌病脂代谢紊乱的认识,对糖尿病心肌病的防治具有重要的理论和实践意义。在正常心肌细胞中,脂肪酸在线粒体和过氧化物酶体中经β氧化途径进行氧化,肌型-肉毒碱脂酰转移酶Ⅰ(muscle-carnitine palmitoyltransferaseⅠ,M-CPTⅠ)、脂酰辅酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase, ACOX)分别是两途径的限速酶。在心肌细胞过氧化物酶体中,ACOX有ACOX1、ACOX2种亚型,ACOX1主要参与直链脂肪酸氧化,ACOX2主要参与2-甲基支链脂肪酸氧化。过氧化物酶体脂肪酸β氧化除了ACOX外,还涉及L-双功能蛋白(L-bifunctional protein,LBP)和D-双功能蛋白(D-bifunctional protein,DBP)。心脏脂肪酸氧化可由过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)上调其下游基因M-CPTⅠ、ACOX的表达加速。实验研究显示,在链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠的心肌细胞中,PPARα、M-CPTⅠ和ACOX mRNA表达增加。那么,在糖尿病时,心肌细胞过氧化物酶体中其他脂肪酸氧化的酶DBP、LBP表达如何,未见报道。另外,STZ诱导的糖尿病大鼠在病程晚期,心脏PPARαmRNA表达下降。那么,心肌脂肪酸氧化相关酶基因ACOX、M-CPTⅠ、DBP、LBP的表达是否也随着病程的进展而发生变化,未见报道。临床上广泛用于高脂血症的治疗的非诺贝特(Fenofibrate)药物,通过激活PPARα,上调参与脂代谢的基因的表达,促进脂肪酸的分解,调节脂代谢。那么,给予PPARα激动剂非诺贝特后,正常大鼠和糖尿病大鼠心肌脂肪酸氧化相关酶基因表达如何变化,未见报道。本实验用STZ破坏大鼠胰岛的β细胞,建立实验性糖尿病大鼠模型,动态观察该状态下心肌细胞线粒体、过氧化物酶体中ACOX1、ACOX2、M-CPTⅠ、DBP、LBP的表达情况;另外,用PPARα激动剂非诺贝特激活PPARα,观察正常大鼠和糖尿病大鼠心肌PPARα下游基因与脂肪酸氧化相关酶的基因表达变化,为探讨糖尿病心肌脂代谢紊乱的发生机理提供实验依据。方法:1动物分组及取材将雄性Wistar大鼠(体重200-250g)随机分为正常对照组(C)和糖尿病组(D)。禁食12h后,糖尿病组大鼠一次性腹腔注射2% STZ(STZ临用前用0.1M,pH4.5柠檬酸钠缓冲液配制)65mg/kg,注射后72h,空腹血糖浓度大于16.7mmol/L的大鼠定为糖尿病大鼠;正常对照组大鼠腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。一部分正常大鼠、糖尿病大鼠分别在成功造模后6周末、12周末给予实验处理,作为正常对照6周组(C6)、糖尿病大鼠6周组(D6)和正常对照12周组(C12)、糖尿病大鼠12周组(D12);另一部分正常大鼠、糖尿病大鼠在成功造模后4周末给予PPARα激动剂非诺贝特(用生理盐水溶解)100mg/kg/day灌胃,连续两周,于6周末给予实验处理,作为正常对照6周+非诺贝特组(C6+F)和糖尿病大鼠6周+非诺贝特组(D6+F)。实验动物处理前禁食12h,次日腹腔内注射10%水合氯醛(0.37g/kg)进行麻醉,颈动脉插管取血,分离血清用于血糖、血甘油三酯的测定;打开胸腔,迅速取出心脏,剪去血管和心脏周围结缔组织,用4℃预冷生理盐水冲洗,滤纸吸干,取5×5×5mm3左室心肌组织,固定于4%多聚甲醛溶液中,用于光镜检测;其余组织立即置于液氮中,然后于-70℃保存,用于总RNA的提取。2血糖、血甘油三酯的测定应用日本生产的Olympus AU600型全自动生化分析仪,氧化酶法测定血糖、血甘油三酯。3心肌细胞形态学检测取部分左心室组织,固定于4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋、切片、HE染色,光镜观察心肌细胞形态学改变。4 mRNA表达的测定用Trizol法提取心肌组织总RNA。以GAPDH作为内参照,RT-PCR法测定心肌ACOX1、ACOX2、M-CPTⅠ、DBP、LBP mRNA的相对表达量。5数据处理所有数据均用?x±s表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学处理分析,组间比较用单因素方差分析检验,检验以P<0.05为差异有显著性意义。结果:1大鼠腹腔注射STZ 72h后空腹血糖的变化腹腔注射STZ 72h后,糖尿病组(25.0415±2.35903mmol/L)的空腹血糖明显高于正常对照组(6.9056±1.08383mmol/L,p<0.01)。表明成功建立糖尿病大鼠模型。2正常大鼠和糖尿病不同时期大鼠空腹血糖的变化糖尿病6周组(27.9576±4.64537mmol/L)和糖尿病12周组(27.7820±4.23858mmol/L)的空腹血糖都明显高于正常对照组(5.5256±2.22392mmol/L,p<0.01)。表明糖尿病大鼠始终处于高血糖状态。3正常大鼠和糖尿病不同时期大鼠心肌组织HE染色结果正常对照组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,呈椭圆形,胞浆染色均匀;糖尿病6周组心肌细胞排列尚整齐,细胞核大小不甚规则,胞浆染色不均匀;糖尿病12周组心肌细胞排列紊乱,细胞核固缩,胞浆自溶。4正常大鼠和糖尿病不同时期大鼠心肌各目的基因mRNA的相对表达量的变化4.1 ACOX1 mRNA的相对表达量正常对照组为0.8733±0.10765,糖尿病6周组为0.7076±0.08473,糖尿病12周组为1.2333±0.22422。其中,糖尿病12周组的ACOX1 mRNA的相对表达量明显高于正常对照组(p<0.01),是正常对照组的1.4倍。提示在糖尿病12周末时,心肌PPARα被激活,间接反映过氧化物酶体直链脂肪酸氧化增强。4.2 ACOX2 mRNA的相对表达量正常对照组为0.2308±0.07548,糖尿病6周组为0.2525±0.06791,糖尿病12周组为0.3582±0.03890。其中,糖尿病12周组的ACOX2 mRNA的相对表达量明显高于正常对照组(p<0.01),是正常对照组的1.6倍。提示在糖尿病12周末时,心肌PPARα被激活,间接反映过氧化物酶体支链脂肪酸氧化增强。4.3 M-CPTⅠmRNA的相对表达量正常对照组为0.3356±0.05994,糖尿病6周组为0.3779±0.06062,糖尿病12周组为0.4582±0.06817。其中,糖尿病12周组的M-CPTⅠmRNA的相对表达量高于正常对照组(p<0.01),是正常对照组的1.4倍。说明在糖尿病12周末时,心肌PPARα被激活,间接反映线粒体脂肪酸氧化增强。4.4 DBP mRNA的相对表达量正常对照组为0.6760±0.12554,糖尿病6周组为0.6798±0.12798,糖尿病12周组为1.2939±0.24959。其中,糖尿病12周组的DBP mRNA的相对表达量明显高于正常对照组(p<0.01),是正常对照组的1.9倍。可见DBP mRNA的相对表达量的变化与ACOX1、ACOX2、M-CPTⅠ的变化一致,也可间接反映在糖尿病12周末时,过氧化物酶体脂肪酸氧化增强。4.5 LBP mRNA的相对表达量正常对照组为0.2232±0.05619,糖尿病6周组为0.2397±0.06629,糖尿病12周组为0.3129±0.02448。其中,糖尿病12周组的LBP mRNA的相对表达量高于正常对照组(p<0.01),是正常对照组的1.4倍。可见LBP mRNA的相对表达量的变化与ACOX1、ACOX2、M-CPTⅠ的变化也一致,可间接反映在糖尿病12周末时,过氧化物酶体脂肪酸氧化增强。5 PPARα激动剂非诺贝特对糖尿病大鼠血甘油三酯的影响糖尿病6周组大鼠的血甘油三酯(1.4000±0.46279)明显高于正常对照组(0.6471±0.18172,p<0.01),而糖尿病6周+非诺贝特组(0.7111±0.31167)明显低于糖尿病6周组(p<0.01),与正常对照组的差别无统计学意义(P>0.05)。表明非诺贝特可有效降低糖尿病大鼠血甘油三酯。6 PPARα激动剂非诺贝特对大鼠心肌各目的基因mRNA相对表达量的影响6.1 ACOX1 mRNA的相对表达量正常对照6周+非诺贝特组心肌ACOX1 mRNA的相对表达量( 1.5508±0.21766 )明显高于正常对照组(0.8733±0.10765,p<0.01),是正常对照组的1.8倍;糖尿病6周+非诺贝特组(0.9002±0.20649)和糖尿病6周组(0.7076±0.08473)之间,心肌ACOX1 mRNA的相对表达量的差别无统计学意义(P>0.05)。可见,非诺贝特只能使正常大鼠心肌ACOX1表达增加,而不能使糖尿病大鼠心肌ACOX1表达增加。说明非诺贝特只能使正常大鼠心肌PPARα激活,而不能激活糖尿病大鼠心肌PPARα。6.2 ACOX2 mRNA的相对表达量正常对照6周+非诺贝特组心肌ACOX2 mRNA的相对表达量( 0.3954±0.13927 )明显高于正常对照组(0.2308±0.07548,p<0.01),是正常对照组的1.7倍;糖尿病6周+非诺贝特组(0.3012±0.06550)和糖尿病6周组(0.2525±0.06791)之间,心肌ACOX2 mRNA的相对表达量的差别无统计学意义(P>0.05)。可见,非诺贝特只能使正常大鼠心肌ACOX2表达增加,而不能使糖尿病大鼠心肌ACOX2表达增加。说明非诺贝特只能使正常大鼠心肌PPARα激活,而不能激活糖尿病大鼠心肌PPARα。6.3 M-CPTⅠmRNA的相对表达量正常对照6周+非诺贝特组心肌M-CPTⅠmRNA的相对表达量( 0.4591±0.07063 )高于正常对照组(0.3356±0.05994,p<0.01),是正常对照组的1.4倍;糖尿病6周+非诺贝特组(0.3963±0.06215)和糖尿病6周组(0.3779±0.06062)之间,心肌M-CPTⅠmRNA的相对表达量的差别无统计学意义(P>0.05)。可见,非诺贝特只能使正常大鼠心肌M-CPTⅠ表达增加,而不能使糖尿病大鼠心肌M-CPTⅠ表达增加。说明非诺贝特只能使正常大鼠心肌PPARα激活,而不能激活糖尿病大鼠心肌PPARα。6.4 DBP mRNA的相对表达量正常对照6周+非诺贝特组心肌DBP mRNA的相对表达量(1.2245±0.07843)明显高于正常对照组(0.6760±0.12554,p<0.01),是正常对照组的1.8倍;糖尿病6周+非诺贝特组(0.8563±0.18792)和糖尿病6周组(0.6798±0.12798)之间,心肌DBP mRNA的相对表达量的差别无统计学意义(P>0.05)。说明非诺贝特只能使正常大鼠心肌DBP表达增加,而对糖尿病大鼠心肌DBP表达无影响。6.5 LBP mRNA的相对表达量正常对照6周+非诺贝特组心肌LBP mRNA的相对表达量(0.3606±0.03506)高于正常对照组(0.2232±0.05619,p<0.01),是正常对照组的1.6倍;糖尿病6周+非诺贝特组(0.2791±0.07178)和糖尿病6周组(0.2397±0.06629)之间,心肌LBP mRNA的相对表达量的差别无统计学意义(P>0.05)。说明非诺贝特只能使正常大鼠心肌LBP表达增加,而对糖尿病大鼠心肌LBP表达无影响。结论:1糖尿病时,心肌脂肪酸氧化的增强不仅与线粒体脂肪酸氧化增强有关,还与ACOX1、ACOX2、DBP、LBP表达增加导致的过氧化物酶体脂肪酸氧化增强有关。2糖尿病时,心肌脂肪酸代谢紊乱与PPARα-ACOX、PPARα-M-CPTⅠ调节途径的变化有关。