目的:前列腺癌（PCa）严重威胁我国男性人群身心健康,是成为我国重要公共卫生问题之一[1]。中国的PCa患者约70%在初诊时已是中晚期,5年生存率只有53.8%,这为我国前列腺恶性肿瘤的治疗带来了巨大的挑战[2]。在关于PCa的基础研究中,除了传统的编码蛋白基因的突变或异常表达,近来越来越多的研究表明非编码RNA（nc RNA）特别是长链非编码RNA（lnc RNA）的突变和异常表达,在癌症的发生发展中也扮演了重要角色[3]。本研究通过生物信息学方法在数据库中挖掘和筛选,筛选鉴定出基因表达与前列腺癌（PCa）的恶性程度和患者生存预后密切相关并同时具有相关性的lnc RNA、miRNA以及m RNA基因,并通过基础实验验证能对前列腺癌的生物学行为有影响的ceRNA网络,为临床PCa的诊断和治疗提供新的思路和方向。方法:1.在数据库中分析与前列腺癌生长和预后密切相关的lnc RNA/miRNA/m RNA,预测待验证的ceRNA网络:从TCGA（https://cancergenome.nih.gov/）数据库中筛选出前列腺腺癌数据集（PRAD）[4]。该数据集共纳入440名组织学类型为PCa的患者资料,一共440例PCa组织,48例正常前列腺组织。由于本数据集中关于患者的总生存时间的数据较少,因此选择无进展生存期（PFS）作为预后分析参数。采用R软件的“limma”软件包进行差异分析。PCa肿瘤与正常前列腺组织中,设定如果FC＞1.5或FC＜2/3相当于|log~2FC|＞0.584963且p值调整值＜0.01,则认为存在显著差异表达基因。生存分析采用Cox回归分析,p＜0.01为生存差异显著。利用在线数据库Lnc Base,miRwalk和Targetscan预测lnc RNA、miRNA和m RNA的靶点。预测出表达量与前列腺癌恶性程度及预后强相关的ceRNA网络,即lnc AC004447.2/miR-133b/SDCCAG,根据HGNC相关命名规则将lnc AC004447.2命名为lncHUPC1[5]。通过相关数据库明确lncHUPC1的染色体位置和碱基结构。2.收集临床样本进行数据分析,验证预测的ceRNA网络,即lncHUPC1/miR-133b/SDCCAG3在组织标本的表达以及与PCa的临床特征关系:本研究中使用的组织样本来自2018年11月至2021年11月期间就诊于重庆医科大学附属第一医院泌尿外科的70例PCa患者。患者的组织样品经过采集后,保存在-80℃的液氮罐中。本回顾性研究分析了患者的基线情况、PSA、Gleason评分以及TNM分期情况。本课题的研究内容已经过重庆医科大学伦理委员会批准,严格按照《赫尔辛基宣言》的准则进行。首先使用q-PCR来检测前列腺癌组织中lncHUPC1、miR-133b、SDCCAG3的RNA水平表达的情况,并结合临床病理资料分lncHUPC1/miR-133b/SDCCAG3的表达与临床病理特征和总体预后的关系。3.体外实验研究验证lncHUPC1通过miR-133b/SDCCAG3影响PCa细胞的凋亡和生长的现象并探讨机制:用q-PCR检测lncHUPC1/miR-133b/SDCCAG3在4种常见的前列腺癌细胞系（LNCa P、22RV1、DU145、PC3）及前列腺正常上皮细胞（RWPE-1）中的表达情况,从中挑选出表达量差异最明显的LNCa P和22RV1两种PCa细胞以及RWPE-1细胞株用于后续实验。FISH探针和q-PCR结合共同验证lncHUPC1的表达的细胞亚定位,3’-RACE和5’-RACE实验验证lncHUPC1的全长序列是否与数据库中相符合。Western blot检测各个细胞株中的SDCCAG3和Fas凋亡通路的下游因子cleaved cas8、cleaved cas3表达情况。在前列腺癌细胞中通过带绿荧光的慢病毒转染构建敲低lncHUPC1的稳转细胞株（sh lncHUPC1）及其空载慢病毒对照组（sh control）,用倒置荧光显微镜观察转染情况;在转染了慢病毒的PCa细胞中,再使用miR-133b inhibitor和miR-133b mimic进行转染以降低或者增强miR-133b的表达,构建出以下4个试验组（1）双对照组:sh control+miR NC,（2）敲低lncHUPC1加miR NC组:sh lncHUPC1+miR NC,（3）敲低lncHUPC1加抑制miR-133b组:sh lncHUPC1+miR-133b inhibitor,（4）敲低lncHUPC1加增强miR-133b组:sh lncHUPC1+miR-133b mimic。分别使用q-PCR验证其转染效率。平板克隆形成实验和CCK-8实验用来检测不同处理组中细胞的生长情况。凋亡相关试剂（Hoechst/PI原位染色）染色和流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。4、通过荧光素酶实验及Ch IRP-q PCR验证lncHUPC1与miR-133b,miR-133b与SDCCAG3之间互相能靶向结合:构建lncHUPC1和SDCCAG3的相关预测结合位点的荧光素酶质粒,通过和miR-133b mimic共培养,通过双荧光素酶实验验证lncHUPC1与miR-133b、miR-133b与SDCCAG3的3’UTR能靶向结合。构建lncHUPC1多节段的探针,Ch IRP-q PCR实验定量验证lncHUPC1与miR-133b的富集丰度再次验证它们之间是否能靶向结合。5、体内实验验证采用裸鼠皮下成瘤和骨转移瘤模型研究敲低lncHUPC1对PCa细胞生长及凋亡的影响:使用裸鼠构建PCa细胞株的皮下移植瘤模型和骨转移瘤模型,使用慢病毒稳转的sh lncHUPC1（敲低实验组）和sh control（空白对照组）的22RV1细胞进行成瘤。通过测量皮下成瘤的大小绘制生长曲线以及称量瘤体的重量以及瘤体的ki67、SDCCAG3、cleaved cas8的IHC分析验证敲低lncHUPC1后PCa生长减缓,凋亡增加。另有部分的裸鼠通过胫骨注射PCa细胞形成骨转移瘤模型（分组同前）,X射线成像验证骨转移灶形成,测量并计算瘤体的重量以及占后腿的比例,同样对瘤体进行HE染色观察对骨质的破坏程度和IHC测cleaved cas8分析凋亡程度。6、数据库分析lncHUPC1的上游转录因子,采用Ch IP-q PCR和双荧光素酶报告实验在PCa细胞中进行验证:通过TRlnc和JASPAR数据库预测启动lncHUPC1转录的上游相关转录因子,初步推测FOXA1可能性较大,通过质粒敲低FOXA1分析lncHUPC1及SDCCAG3的表达变化;构建lncHUPC1的预测启动子区域的荧光素酶质粒,通过与FOXA1敲低质粒的共培养,双荧光素酶验证lncHUPC1启动子区域与FOXA1是否能靶向结合,Ch IP-q PCR实验通过分析FOXA1蛋白抗体富集的lncHUPC1的DNA丰度再次验证FOXA1能与lncHUPC1的启动子区域靶向结合,促进其转录。结果:1、通过生物信息学方法在数据库中的分析得出:在PCa中,lncHUPC1、SDCCAG3在前列腺癌组织中高表达,miR-133b在正常前列腺癌组织中高表达,而且lncHUPC1、SDCCAG3高表达的患者PFS时间短,miR-133b高表达的患者PFS生存时间长;lncHUPC1、miR-133b、SDCCAG3在PCa中的表达均具有相关性。2、PCa组织样本收集及回顾性分析显示,lncHUPC1、SDCCAG3在PCa的癌组织中较癌旁组织表达升高,miR-133b则反之在PCa癌组织中表达较低,而且GS评分高（＞7）的患者lncHUCP1和SDCCAG3的表达较高,miR-133b的表达较低,lncHUPC1与miR-133b、miR-133b与SDCCAG3呈负相关表达,lncHUPC1与SDCCAG3的表达呈正相关。3、体外细胞实验中,敲低lncHUPC1后,PCa细胞的生长减缓,凋亡增加,miR-133b、cleaved cas8、cleaved cas3的表达增加,SDCCAG3表达降低;而再敲低miR-133b后PCa细胞的生长又能回复一部分,凋亡减少,引起SDCCAG3增加和cleaved cas8、cleaved cas3的表达降低;而过表达miR-133b后细胞的凋亡最多生长更加减缓,SDCCAG3的表达更低,cleaved cas8、cleaved cas3的表达增多。4、在Ch IRP中,相比较于Lac Z组,Ch IRP-q-PCR结果miR-133b或lncHUPC1的表达在奇偶探针组中都较Lac Z对照组的高。双荧光素酶检测结果显示,miR-133b mimic转染后降低了含有野生型lncHUPC1（WT）载体的荧光素酶活性,但未能降低lncHUPC1突变型载体（mut）的荧光素酶活性,提示miR-133b可能直接与lncHUPC1靶向结合。双荧光素酶检测结果显示,转染miR-133b mimic后,含有SDCCAG3m RNA野生型载体（wt）组的荧光素酶活性明显降低,但不能降低突变型载体（mut）突变组的荧光素酶活性,说明miR-133b可以直接与SDCCAG3 m RNA靶向结合。5、PCa细胞在裸鼠体内形成皮下或骨移植瘤后,敲低lncHUPC1能减缓瘤体生长,SDCCAG3表达减少,凋亡相关的下游因子cleaved cas8表达增多;6、数据库预测FOXA1可能是促进lncHUCP1转录的上游转录因子,敲低FOXA1后lncHUCP1和SDCCAG3的表达均降低。lncHUPC1的启动子区域有FOXA1结合的靶点,FOXA1的蛋白抗体能明显富集lncHUPC1的DNA。结论:基于上述研究结果,我们检索出了一个能促进前列腺癌生长的还未被研究过的lnc RNA:lncHUPC1,同时研究了lncHUPC1如何在体外和体内环境中通过与miR-133b/SDCCAG3形成ceRNA网络对前列腺癌细胞的凋亡产生抑制作用从而促进肿瘤生长,而且该ceRNA网络可能是通过FOXA1作为转录因子启动的。总之,lncHUPC1以及FOXA1/lncHUPC1/miR-133b/SDCCAG3调控轴可能成为前列腺癌诊断的标志物,将来成为治疗研究的新靶点和方向。