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目的:肝脏既是清除内毒素的主要场所,同时也是内毒素血症受损最早、最明显的靶器官之一。肝损伤后可导致大量内毒素溢入体循环进而引起多器官损伤。赶黄草具有显著的保肝护肝疗效,但目前未见有报道用于内毒素性肝损伤。因此本研究旨在(1)筛选赶黄草不同溶剂粗提取物抗内毒素性肝损伤的有效提取物;(2)对赶黄草粗提取物抗内毒素性肝损伤的有效提取物进行分级萃取,进一步筛选赶黄草抗内毒素性肝损伤的有效部位以及以非特异性免疫为切入点进行机制初探。方法:(1)赶黄草粗提取物:(1)采用不同溶剂(水、70%乙醇、95%乙醇)按固液比为1:10对赶黄草粉末进行水浴回流提取,收集提取液浓缩得赶黄草浸膏,并计算出膏率。(2)体外细胞模型筛选:MTS法、酶标仪检测RAW264.7细胞增殖的OD值,并计算增殖相对百分率(reletive growth rate,RGR),以评价赶黄草粗提取物对RAW264.7细胞的安全浓度;Giemsa法观察内毒素诱导后RAW264.7细胞形态学改变;ELISA法测定细胞上清液炎性因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrotic factor-α,TNF-α)的含量以此评价LPS诱导RAW264.7细胞活化最适浓度及赶黄草粗提取物抑制LPS诱导RAW264.7细胞活化的最佳部位。(3)体内动物实验验证:昆明种小鼠,随机分为空白对照组,内毒素肝损伤模型组,肝苏颗粒+内毒素致小鼠肝损伤组(阳性对照),70%乙醇提取物+内毒素致小鼠肝损伤组,95%乙醇提取赶黄草药+内毒素致小鼠肝损伤组,水提物+内毒素致小鼠肝损伤组。除空白组外每组事先分别尾静脉注射LPS(4mg·kg-1)造成内毒素致小鼠肝损伤模型。各药物组分别在LPS注射前12h和后2h灌胃给药,LPS注射12h后,采集小鼠腹主动脉血液,并分离血清,采集小鼠肝组织,部分石蜡包埋切片用于病理组织学检测,部分用于制备组织匀浆。赖氏法测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;超氧化物歧化酶法测定肝组织匀浆用于检测超氧物歧化酶(SOD)、TBA法检测丙二醛(MDA)含量。(2)赶黄草萃取物:(1)赶黄草70%乙醇浸膏,按浸膏:温水=1:10(W/V)的比例65℃水浴溶解成水悬液,依次采用3倍量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇65℃水浴萃取三次,分别收集各萃取液浓缩干燥得石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位,并计算萃取率。(2)体外模型筛选和体内动物实验验证:同(1)。(3)机制初探:免疫荧光法检测LPS诱导凋亡相关的斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD domain,ASC)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRP3)表达的最适浓度以及赶黄草萃取物对LPS诱导ASC和NLRP3表达的影响。结果:(1)赶黄草粗提取物出膏率以及分级萃取物萃取率:(1)粗提取物:赶黄草70%乙醇、95%乙醇和水提取物的出膏率分别为13.8%、13.4%和15.8%。(2)萃取物:赶黄草石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物的萃取率依次为2.75%、30.66%和17.54%。(2)赶黄草粗提取物以及萃取物安全浓度:(1)粗提物:赶黄草70%乙醇、95%乙醇、水提取物的浓度分别≤100mg·L-1、25mg·L-1、400mg·L-1时细胞毒性分级≤1级。(2)萃取物:石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物的浓度分别≤50mg·L-1、100mg·L-1、400mg·L-1时细胞毒性分级≤1级。(3)LPS诱导RAW264.7细胞活化的最适浓度:倒置显微镜下(×200),空白组RAW264.7细胞呈圆形,细胞突起较少,细胞边界清楚;0.25mg·L-1-8mg·L-1 LPS组细胞出现伪足增加、细胞边缘不清、形态不规则等细胞活化的标志;与空白组相比,0.25 mg·L-1-8 mg·L-1浓度LPS组RAW264.7细胞释放IL-1β和TNF-α明显增加(P<0.05,P<0.01);(4)赶黄草粗提取物以及萃取物抑制RAW264.7细胞活化的最佳部位:(1)倒置显微镜下观察(×400),70%乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物相比其他几组药物更能明显改善LPS诱导RAW264.7细胞形态学变化。(2)与LPS组比较,赶黄草70%乙醇提取物在50mg·L-1、25 mg·L-1、12.5 mg·L-1浓度时均可明显降低细胞上清液IL-1β、TNF-α水平(P<0.05,P<0.01);水提取物在50 mg·L-1,25 mg·L-1浓度时均可降低细胞上清液IL-1β、TNF-α水平(P<0.05,P<0.01);乙酸乙酯萃取物在50 mg·L-1、25 mg·L-1浓度时可明显降低细胞上清液IL-1β、TNF-α水平(P<0.05,P<0.01),12.5 mg·L-1浓度时可明显降低细胞上清液TNF-α水平(P<0.05);正丁醇萃取物在50 mg·L-1浓度时均可降低细胞上清液IL-1β、TNF-α水平(P<0.05)。(5)赶黄草粗提取物以及萃取物抗小鼠内毒素性肝损伤的最佳部位:(1)病理组织学改变:与LPS组相比,肝苏颗粒+LPS组、70%乙醇提取物+LPS组、乙酸乙酯萃取物+LPS组、正丁醇萃取物+LPS组小鼠肝组织损伤有所改善,炎性渗出有所减轻。(2)血清中:与空白组比较,其余各组血清中ALT、AST水平均明显升高(P<0.01)。与模型组比较,肝苏颗粒组、70%乙醇提取物组、正丁醇萃取物组血清中AST水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,肝苏颗粒、70%乙醇提取物组、水提取物组和乙酸乙酯萃取物组血清中ALT水平明显降低(P<0.01)。(3)肝组织匀浆中:与空白组比较,各组SOD水平变化不明显,模型组MDA水平明显上升(P<0.01)。与模型组比较,阳性药肝苏颗粒组、70%乙醇提取物组、石油醚萃取物组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组MDA水平明显下降(P<0.05,P<0.01)。(6)免疫荧光检测:(1)与空白组比较,1 mg·L-1-8 mg·L-11 LPS组的NLRP3和ASC的表达均上调,其中2mg·L-1,4mg·L-11 LPS组最明显。(2)乙酸乙酯和正丁醇组细胞ASC和NLRP3较LPS组表达明显降低,且乙酸乙酯的作用更强。石油醚组ASC和NLRP3与LPS组比较没有明显变化结论:(1)赶黄草三种不同溶剂粗提取物中70%醇提取物抗LPS性肝损伤的活性最好。(2)赶黄草70%乙醇提取物的分级萃取物中,抗LPS性肝损伤的主要成分集中在乙酸乙酯部位。(3)赶黄草抗内毒素性肝损伤可能与调控ROS/NLRP3/IL-1β通路有关。