【摘 要】
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近年来,我国兔养殖业快速发展,但兔病毒性疾病的发生极大制约了兔养殖业的发展。其中兔轮状病毒病在兔群中传播极为广泛,引起幼龄仔兔的严重腹泻,病死率非常高,而且极易造成继发感染。目前,尚未有疫苗及特效治疗药物预防和治疗该病。干扰素是动物机体重要的先天性免疫防御因子,具有广谱的抗病毒活性,已广泛用于人和一些动物病毒病的防治,但在兔轮状病毒防治方面尚未见报道。本研究利用基因工程获得兔重组α/β干扰素高效表
【基金项目】
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山东省重点研发计划（2022CXGC010606 ）； 山东省重大技术集成重点研发项目（2019JZZY010735）； 山东省现代农业产业技术体系创新团队岗位专项项目（SDAIT-21-6）（SDAIT-21-10）；
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近年来,我国兔养殖业快速发展,但兔病毒性疾病的发生极大制约了兔养殖业的发展。其中兔轮状病毒病在兔群中传播极为广泛,引起幼龄仔兔的严重腹泻,病死率非常高,而且极易造成继发感染。目前,尚未有疫苗及特效治疗药物预防和治疗该病。干扰素是动物机体重要的先天性免疫防御因子,具有广谱的抗病毒活性,已广泛用于人和一些动物病毒病的防治,但在兔轮状病毒防治方面尚未见报道。本研究利用基因工程获得兔重组α/β干扰素高效表达载体,制备活性蛋白表达产物,体内体外试验分析其抗兔轮状病毒活性,为兔轮状病毒病临床防制提供科学依据。第一,根据兔α/β干扰素基因序列,设计引物,PCR扩增各自成熟肽目的基因,经密码子优化后构建各自重组原核表达载体,优化反应条件,建立稳定制备目的蛋白的反应体系和纯化、复性、浓缩工艺。第二,利用VSV/RK-13、VSV/MA-104、VSV/VERO和VSV/CEF系统,使用细胞病变抑制法测定表达产物的抗病毒生物活性和特性。第三,利用MA-104细胞结合荧光定量检测LaRV体外增殖试验分析表达产物抗LaRV活性。第四,开展动物试验,结合病毒含量和组织病理学等检测,评价两种表达产物对兔感染LaRV的保护作用。结果显示,PCR扩增获得兔α/β干扰素成熟肽基因大小为501 bp、480 bp;经优化后构建高效原核表达重组载体pET-32a-RIFN-α和pET-32a-RIFN-β;经IPTG诱导获得分子量分别约为38 KDa、36 KDa重组蛋白,最佳诱导时间分别为4h、6h,纯化蛋白浓度分别达到439μg/mL、245μg/mL。经透析和PEG浓缩可得到纯度均大于98%,浓度分别为854μg/mL、558μg/mL的目的蛋白。复性后的α/β干扰素表达产物VSV/RK-13抗病毒活性分别为7.56×10~5U/mg、6.66×10~4U/mg;但在VSV/MA-104上仅兔α干扰素表达产物有抗病毒活性为93.01 U/mg,在VSV/VERO、VSV/CEF细胞上二者均无任何抗病毒活性。MA-104细胞体外抗LaRV试验结果显示5～10μg/mL的兔α、β干扰素均显著抑制LaRV的复制,且α干扰素表达产物显著高于β干扰素。动物试验显示重组兔α、β干扰素对兔LaRV感染的预防保护率分别为90%（9/10）和80%（8/10）;实时荧光定量PCR结果显示兔α、β干扰素表达产物均能显著抑制LaRV的感染和增殖,前者的抑制病毒活性更高;组织病理学结果显示,阳性对照组兔产生肠壁变薄、肠绒毛出现空泡化、肠上皮细胞和肠绒毛脱落等严重病变,IFN-α+LaRV组、IFN-β+LaRV组未见上述病变。以上结果可以看出,所构建的兔α、β干扰素的原核高效表达质粒能够制备较高纯度的抗病毒活性蛋白,能抑制兔轮状病毒体内体外复制,对该病毒的感染具有较高的保护作用。
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