论文部分内容阅读
目的：
1、分析2型糖尿病(T2DM)患者线粒体DNA(mtDNA)16SrRNA基因的变异情况，探讨16SrRNA基因变异与T2DM及其慢性并发症之间的关系。
2、探讨16SrRNA基因突变是否与tRNALeu(UUR)A3243G突变同时对T2DM发生作用，为进一步功能学研究提供实验数据。
方法：
1、随机收集浙江地区人群中无血缘关系T2DM患者210例，均根据1997年WHO糖尿病诊断标准确诊，并记录患者常规生化指标及基本临床资料；随机收集年龄、性别等与病例组相匹配的健康对照人群140例，无相关糖尿病及其并发症病史，并排除糖尿病家族史、糖耐量异常、高血压、高血脂、脑血管病变等。
2、提取全血基因组DNA，采用PCR扩增mtDNA16SrRNA基因片段，直接测序后与剑桥参考序列(revisedCambridgeReferenceSequence，rCRS)进行比对，分析其变异情况；利用Clustalx生物软件分析碱基序列保守性，并利用MFOLD:PredictionofRNAsecondarystructure(M.Zuker)软件对16SrRNA二级结构进行预测，分析其自由能变化；结合统计学分析16SrRNA基因变异与糖尿病生化指标及慢性并发症的相关性。
3、采用PCR-RFLP方法对存在mtDNA16SrRNA基因变异的标本进行线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变筛查，阳性标本进一步用变性高效液相色谱分析技术(DHPLC)及正反向测序方法确认，并分析阳性标本的mtDNA全序列及临床遗传特点。
结果：
1、210例T2DM患者中共发现mtDNA16SrRNA基因41个变异，其中22个未报道，28个只出现在病例组；140例正常对照中共发现25个变异，其中11个未报道。所有变异在两组间差异无显著性。
2、从物种进化保守性角度发现mtDNA16SrRNA基因上7个变异位于人、牛、鼠、非洲爪蟾四个物种高度保守的区域：A1736G、A1811G、T1850C、A1909G、A2195G、A2281G、A2833G。除A1736G同时出现在病例组和正常对照组中，其余变异均只出现在病例组中。
3、mtDNA16SrRNA基因A2706G变异在病例组和对照组所有标本中均出现，变异率为100％，可作为中国浙江人群线粒体基因的正常参考位点。
4、mtDNA16SrRNA基因二级结构预测发现：C1715T、T1850C、G1927A、A2581G、T2898C、G3010A、T3083C、3173insC、A3209T等突变使自由能比野生型高，C1715T、3173insC、A3209T使其二级结构发生明显变化，C1715T、T1850C、T2898C、T3083C只在病例组中出现且T1850C位于高度保守区域，推测这些突变与糖尿病存在一定的关系；C1734T、A1735G、A1736G、A1810G、A1811G、G1970A、A1927G、A2195G、A2246G、A2315G、C2389T、C2766T、T3150C、A3190G、C3206T等变异使自由能比野生型低，使整个结构更稳定，推测这些变异是在进化过程中产生的保护性改变。
5、含有16SrRNA基因变异的有家族史患者中女性发病率、HbAlc、FPG、LDL-C明显比无家族史患者高，并发症视网膜病变、周围神经病变和肾病也更容易在有家族史组的患者中发生。
6、16SrRNA基因各变异在并发高血压组和未并发高血压组、并发视网膜病变组和未并发视网膜病变组、并发肾病组和未并发肾病组、并发周围神经病变组和未并发周围神经病变组中无显著统计学差异，但由于很多变异只在病例组中出现一次，不能排除其中某些位点与糖尿病慢性并发症相关，需要扩大样本量研究。
7、在84例含16SrRNA基因变异的标本中发现1例线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变阳性标本，其异质率16.30％。mtDNA全序列分析中共发现36个变异，大部分为基因多态性现象。提示线粒体tRNALeu(UUR)A3243G和16SrRNA基因A2581G这两个突变是该患者线粒体性糖尿病发病的主要遗传因素。
8、线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变的糖尿病家系具有以下临床特征：①呈母系遗传方式；②遗传早发现象；⑨胰岛素依赖；④体重指数降低；⑤常伴耳聋。
结论：
1、mtDNA16SrRNA基因存在较多变异，大部分为基因多态性现象。但不能排除C1715T、A1811G、T1850C、A1909G、A2195G、A2281G、A2581G、A2833G、T2898C、T3083C、3173insC、A3209T等对T2DM发病的作用。
2、mtDNA16SrRNA基因A2706G变异率为100％，可作为中国浙江人群线粒体基因的正常参考位点。
3、在有家族史的糖尿病患者更应注意临床生化指标的变化和糖尿病并发症的预防，线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变筛查对线粒体性糖尿病的早期预防、诊断等具有积极的指导作用。