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口腔颌面部因肿瘤、外伤造成的大面积骨缺损修复一直是口腔颌面外科领域的难题之一,目前常用的异体骨移植、自体骨移植等方法。但自体植骨来源极为有限,又增加创伤,而且不能用于修复大面积骨缺损,异体骨移植也存在来源困难,修复效果远不如内源骨,且有免疫排斥反应,可能带有潜在的病原体,例如HIV病毒、肝炎病毒等。
组织工程化骨(tissue engineered bone)研究的发展为修复大面积骨缺损提供了全新的思路和方法.在骨组织工程中,生物支架材料占据着非常重要的地位。它不仅起支撑作用,保持原有组织的形状,而且还起到模板作用,为细胞提供赖以寄宿、生长、分化和增殖的场所,从而引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。骨组织工程的另一大要素为骨种子细胞,骨髓间充质干细胞(MSCs)很容易通过骨髓穿刺而获得,体外可迅速大量扩增,达到原来细胞数目的10~20倍,因而能够满足构建组织的细胞数量要求。更为重要的是细胞在扩增过程中能够保持干细胞的多向分化特征,在特定的环境下能够分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、神经细胞和脂肪细胞。因而目前MSCs是骨组织工程最常用、最理想的种子细胞,被成功地用于骨和软骨组织缺损的修复和重建。基因技术的发展,特别是将基因技术和骨组织工程相结合的基因增强的骨组织工程技术(gene enhanced bone tissueengineering)为临床促进骨缺损修复、缩短骨愈合时间带来了巨大希望。
本研究首先结合密度梯度离心和贴壁培养法,高效、快速地分离出了符合骨组织工程种子细胞数量要求的高纯度MSCs;经矿化诱导,成功地培养出了具有成骨细胞表型的MSCs,可以用做进一步实验的骨组织工程种子细胞。第二:通过建立兔下颌体极限骨缺损(critical sized defects,CSD)的动物模型,探讨MSCs与生物有机高分子基复合材料一纳米级羟基磷灰石/聚酰胺(n-HA/PA66)复合培养后,在体外体内成骨的方式、类型和成骨时间。经大体标本、扫描电镜、X线和组织学观察发现n-HA/PA66多孔仿生骨有良好的组织相容性,足够的强度和韧性,其孔隙范围和HA颗粒含量和分布接近自然骨,是骨组织工程中理想的支架材料;MSCs复合n-HA/PA66修复兔下颌骨缺损,骨缺损修复速度明显快于单纯采用n-HA/PA66修复兔下颌骨缺损。第三通过腺病毒介导将大鼠BMP-7基因转入兔骨髓基质细胞后(MSCs),再与纳米羟基磷灰石/聚酰胺仿生骨(n-HA/PA66)复合后植入兔下颌骨,结果发现大鼠BMP7基因移植兔MSCs后无免疫排斥反应,在支架材料n-HA/PA66生长增殖良好,在实验早期(2~4周)体内新骨形成量明显多于未采用基因技术组(植入MSCs-n-HA/PA66组)。
本研究得出如下结论:
(1)本试验通过结合密度梯度离心和贴壁培养法高效、快速地分离纯化了兔骨髓MSCs;经矿化诱导,成功地培养出了具有成骨细胞表型的MSCs,可以用做进一步实验的骨种子细胞。
(2)n-HA/PA66多孔仿生骨有良好的组织相容性,是骨组织工程中理想的支架材料。
(3)MSCs复合n-HA/PA66修复兔下颌骨缺损能促进骨缺损修复,缩短骨愈合时间。
(4)通过腺病毒介导,体外成功地将大鼠MBP7转染至兔MSCs,无免疫排斥反应;为异种间基因移植提供了一定实验依据。
(5)BMP7-MSCs复合n-HA/PA66在动物体内能早期诱导大量新骨生成,新骨形成量明显多于未采用基因技术组。