研究背景：胸腔积液是一种常见的病理状态。水通道蛋白(AQPs)是具有选择性水通道的同源跨膜蛋白质家族，参与多种细胞膜液体转运。现在已从哺乳动物组织中鉴定出13种水通道蛋白，每种水通道蛋白都能够提高细胞膜的水通透性，提供快速液体转运的途径。水通道蛋白-1(AQP-1)广泛分布于体内，选择性分布在与液体吸收或分泌有关的上皮细胞及可能协同水跨细胞转运的内皮细胞中，参与各种体液的生成和吸收。随着对水通道蛋白的逐步认识，水通道蛋白与多种临床疾病液体转运的相关性近年来已得到重视，为研究胸水转运的分子机制提供了新的角度。但是迄今为止，由于缺乏特异性AQP-1药物抑制剂，且传统的基因敲除由于操作费时、费用昂贵、成功率低等因素均妨碍了AQP-1参与胸水转运的直接研究。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术作为一种新的反向遗传学手段，已引起人们的广泛关注。RNA干扰可以代替基因敲除，提供一种经济、快捷、高效、特异地阻断基因表达的技术手段，为功能基因组学及基因治疗的研究开辟一条新思路。 第一部分水通道蛋白-1在炎症性胸腔积液大鼠胸膜上表达及相关性研究. 一、目的:探讨水通道蛋白-1(AQP-1)在炎症性胸腔积液大鼠胸膜上的表达及其与胸水形成的相互关系。 二、方法: 56只健康Wistar大鼠随机分为对照组和胸膜炎组。对照组胸腔内注入生理盐水，而胸膜炎组采用角叉菜胶胸腔内注射建立炎症性胸腔积液大鼠模型；对照组于胸腔内注入生理盐水后24h处死，而胸膜炎组则于胸腔内注入角叉菜胶6h、12h、24h、36h、48h和72h后处死，每组各8只，应用免疫组织化学法检测AQP-1在大鼠胸膜上的分布；RT-PCR、Western blot方法分别在mRNA和蛋白质水平检测各实验组大鼠脏、壁层胸膜AQP-1表达的变化，同时测定各实验组大鼠胸腔积液量。 三、结果: 免疫组化显示：AQP-1主要表达在脏、壁层胸膜间皮细胞，6h、12h、24h、36h、48h和72h胸膜炎组胸水量分别为2.10±0.22 ml、4.10±0.15ml、4.40±0.36ml、3.20±0.27ml、2.60±0.18ml、0.12±0.02ml。胸膜炎各时相组脏、壁层胸膜AQP-1表达均增强。胸膜炎组AQP-1-mRNA表达量(积分吸光度)：壁层胸膜：6h开始升高，24h达高峰(12.32±1.23)，比对照组(3.38±0.27)明显升高(P<0.01)，脏层胸膜：12h开始升高，24h达高峰(26.65±1.62)，比对照组(6.24±0.54)明显升高(P<0.01)；AQP-1蛋白表达量(积分吸光度)：壁层胸膜：6h开始升高，24h达高峰(68.72±6.92)，与对照组(21.04±1.84)比较明显升高(P<0.01)；脏层胸膜：AQP-1表达12h开始升高，24h达高峰(240.11±21.63)，与对照组(86.84±7.19)比较明显升高(P<0.05)，然后逐渐降低，但仍高于正常对照组；AQP-1蛋白表达增强的时间与胸腔积液量基本一致。 四、结论:胸膜间皮细胞存在AQP-1表达，胸膜炎胸腔积液时胸膜.AQP-1表达增强，AQP-1可能参与炎症性胸腔积液的转运过程。 第二部分质粒表达型shRNA抑制胸膜间皮细胞水通道蛋白-1表达的体外实验. 一、目的:1.观察大鼠胸膜间皮细胞水通道蛋白-1(AQP-1)的表达； 2.构建针对AQP-1基因的AQP-1-pGenesil-1表达质粒； 3.观察AQP-1-pGenesil-1质粒对AQP-1表达的特异性抑制作用，为进一步应用该技术治疗胸腔积液的可行性奠定基础。 二、方法: 体外原代培养大鼠胸膜间皮细胞，细胞鉴定后，采用免疫细胞化学、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测AQP-1表达；设计合成2对靶向大鼠AQP-1基因的siP(NA，构建重组AQP-1-1-pGenesil-1和AQP-1-2-pGenesil-1质粒，酶切鉴定。脂质体转染大鼠胸膜间皮细胞48h后，应用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率，采用RT-PCR及Western blot方法分别在mRNA和蛋白质水平检测AQP-1基因表达的抑制效果。 三、结果: 发现胸膜间皮细胞存在AQP-1表达，所设计的质粒AQP-1-1-pGenesil-1和AQP-1-2-pGenesil-1经酶切鉴定与DNA测序证实构建成功。说明本实验已成功构建了针对AQP-1基因的AQP-1-pGenesil-1重组质粒。AQP-1-pGenesil-1与IApofectamineTM 2000转染比例为1：2.5时，GFP表达最强。细胞转染效率为42％，重组质粒可不同程度的抑制AQP-1在胸膜间皮细胞中的表达，在mRNA水平抑制率分别为：83.45％和90.93％；在蛋白质水平抑制率分别为：41.24％和67.60％，与空白对照组和阴性对照组比较，其差异有统计学意义(P<0.01)。 四、结论:质粒介导的RNAi可明显抑制大鼠胸膜间皮细胞AQP-1基因的表达，且抑制率具有序列相关性，是潜在的胸腔积液基因治疗新方法。 第三部分高渗液和地塞米松对胸膜间皮细胞水通道蛋白-1表达的影响. 一、目的观察胸膜间皮细胞水通道蛋白-1(AQP-1)的表达及高渗状态、地塞米松(Dex)对其表达的影响，为进一步研究胸水治疗的机制提供实验依据。 二、方法: 体外原代培养Wistar大鼠胸膜间皮细胞，细胞鉴定后，采用免疫细胞化学、RT-PCR方法检测AQP-1表达。高渗液对AQP-1表达的影响：细胞随机分为对照组、高渗组和高渗时间组，对照组以正常培养液常规培养细胞，高渗组以含不同浓度NaCI的高渗培养液培养细胞24h；高渗时间组以含100mmol/L NaCI高渗培养液培养细胞6h、12h、18h、24h，建立胸膜间皮细胞对高渗液反应的实验模型，应用Western blot、RT-PCR方法检测细胞中AQP-1表达变化规律。地塞米松(Dex)对AQP-1表达的影响：应用Western blot方法检测以不同浓度Dex(10<-8>，10<-7>，10<-6>，10<-5>，10<-4>mmol/L)处理细胞24h及以10<-4>mmol/L Dex处理细胞6h、12h、24h、36h、48h、72h后AQP-1表达情况。 三、结果: 发现胸膜间皮细胞存在AQP-1表达。含25、50、75、100、150mmol/L NaCI高渗培养液作用于胸膜间皮细胞24h后，AQP-1蛋白表达量(积分吸光度)分别为24.04±1.81，27.84±2.41，31.68±2.53，89.74±6.20，107.66±9.32，分别高于正常对照组(10.80±1.46)2.23，2.56，2.93，8.31，9.97倍(P<0.01)，AQP-1表达与渗透压相关；对照组用正常培养液培养细胞6h、12h、18h、24 h后，AQP-1表达无明显差异(P>0.05)。在相同的作用时间条件下，以100mmol/LNaCI高渗液培养细胞，AQP-1蛋白表达量分别为：42.08±2.57，78.88+3.62，109.61±7.62， 123.41±8.65，分别高于正常对照组(12.91±1.92)3.26，6.11，8.49，9.56倍，差异均有统计学意义(P<0.01)，AQP-1表达与作用时间相关。AQP-1在mRNA水平表达与蛋白水平表达相一致。以10<-8>，10<-7>，10<-6>，10<-5>，10<-4>mmol/L Dex干预胸膜间皮细胞24h后，AQP-1蛋白表达量(积分吸光度)分别为755.04±19.81，843.72±19.41，862.96±26.53，694.80±32.00，938.08±13.32，分别高于正常对照组(372.90±16.46)2.02，2.26，2.31，1.86，2.52倍(P<0.01)，AQP-1表达升高与地塞米松浓度无关；以10<-4>mmol/LDex干预细胞6h，12h，24h，36h，48h，72h后，AQP-1蛋白表达量分别为：554.14±23.57，917.78±38.62，1 587.20±61.22，1 322.09±28.65，918.40±26.62，1117.60±51.32，分别高于正常对照组(495.91±23.12)1.12，1.85，3.20，2.67，1.85，2.25倍(P<0.01)，AQP-1表达与地塞米松作用时间有关。 四、结论:胸膜问皮细胞存在AQP-1表达，高渗液上调胸膜间皮细胞AQP-1表达，且与渗透压及作用时间相关，AQP-1可能参与胸水的转运。地塞米松对胸膜间皮细胞AQP-1表达有明显的增强性调节作用，具有时间依赖性。