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小菜蛾Plutella xylostella(L.),是十字花科作物的重要害虫之一,给全世界十字花科蔬菜生产造成严重的经济损失,其能迅速对杀虫剂产生抗性及有效天敌的匮乏是目前防治工作的“瓶颈”。普通气味结合蛋白是气味结合蛋白家族的一个亚类,是昆虫识别外界环境中气味信号反应的第一载体,负责筛选、结合以及运输疏水性气味分子到达特异性气味受体,对昆虫的生存和繁衍有着重要的意义。明确普通气味结合蛋白在小菜蛾嗅觉识别中的作用可为揭示小菜蛾嗅觉识别分子机制,从而制定有效的防控措施提供科学依据。本研究利用PCR技术克隆和鉴定了 4个小菜蛾普通气味结合蛋白基因PxylOBP6、PxylOBP12、PxylOBP13以及PxylOBP31;利用原核表达系统表达了相应的4个重组蛋白,并利用镍柱纯化重组蛋白;体外测定了重组蛋白与39种挥发性气味物质的结合能力;最后利用荧光免疫技术结合激光共聚焦显微镜对这4个普通气味结合蛋白在组织中的分布进行了定位。主要研究结果如下:1.获得4个普通气味结合蛋白基因PxylOBP6、PxylOBP12、PxylOBP13和PxylOBP31开放阅读框全长序列,GenBank登录号分别为KT156677、KT156678、KT156679、KT156676。4个基因编码蛋白含122～137个氨基酸,相对分子量13.83～14.89KDa,等电点4.41～8.71;均含有气味结合蛋白家族6个保守的半胱氨酸残基与保守结构域;只有PxylOBP31氨基酸序列N端含有信号肽。通过氨基酸序列同源性比对及系统进化树分析,PxylOBP6与PxylOBP31聚为一支,PxylOBP12与PxylOBP13聚为另一支,说明它们分属于GOBP不同亚类;2.构建了 pET28a-PxylOBP6、pET28a-PxylOBP12、pET28a-PxylOBP13、pET28a-PxylOBP31重组表达载体,转化BL21(DE3),重组菌经IPTG诱导表达获得大量目的蛋白。重组蛋白以包涵体形式存在,通过变性、稀释复性和镍柱亲和层析纯化后获得高纯度蛋白。圆二色谱扫描结果显示,4个小菜蛾普通气味结合蛋白的二级结构均以αα螺旋结构为主。3.通过荧光竞争结合实验检测了 4个重组气味结合蛋白与39种化合物的结合能力,结果显示PxylOBP6和PxylOBP13结合谱广泛,均能与性信息素、醇、醛、酮、酯和烯烃类大部分物质结合,且结合能力也都比较强,大部分Ki<10μmol/L,2,6-二叔丁基对甲酚是 PxylOBP6 和 PxylOBP13 的最佳配体。PxylOBP12与酯类及烯烃类物质结合能力强,尤其是长碳链的酯类及烯烃类物质。PxylOBP31与十字花科绿叶气味,醛酮类化合物稳定结合,与性信息素成分和2,5-己二醇不结合。4.通过免疫荧光定位结合激光共聚焦显微镜观察对小菜蛾气味结合蛋白进行定位,只有用抗PxylOBP12处理的切片能观察到绿色荧光,PxylOBP12集中分布触角鞭节的端节和触角鞭节各亚节的连接处,在各鞭节亚节上稀疏分布,在毛形感器中并未发现PxylOBP12被标记。