研究目的：肝癌是世界常见恶性肿瘤之一,我国每年肝癌患者死亡数量占全球一半以上,肝癌已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手。虽然目前用于肝癌治疗的手段有很多,包括手术、放疗、化疗、中医药治疗、免疫治疗和射频消融治疗等,但是疗效都不理想,肿瘤极易复发转移,患者预后较差。因此,迫切需要找到新的治疗方法。随着分子生物学、免疫学的发展和对肿瘤发生分子机制认识的深入,现在人们意识到肿瘤是一种多因子、多步骤和多基因参与的基因病；同时,基因治疗研究的突飞猛进,人们发现从基因水平治疗肿瘤与传统治疗方法适当结合,必将给恶性肿瘤的治疗带来新的希望。近年来,肿瘤基因治疗的突破口在于寻找高效、特异性的靶点。STAT3是信号转导与转录活化因子(Signal Transducers and Activators of Transcription, STAT)家族的重要成员。它在胞浆中是信息的传递者,在胞核中发挥转录激活作用。STAT3蛋白参与了多种细胞因子的信号转导过程,对细胞的生长和存活发挥重要的调控作用。当生长因子与细胞因子等细胞外信号刺激导致STAT3通路活化后,STAT3发生二聚化而进入细胞核,结合于靶基因启动子的特定序列上,通过与其他转录调控元件的相互作用来调控靶基因的表达。目前已发现的STAT3靶基因包括抗凋亡基因bcl-xl、mcl-1和细胞周期控制基因cyclin D1、cyclin E、c-myc和p21等,这些靶基因与细胞增殖、分化、生存、恶性转化及凋亡抑制等活动的调控密切相关。此外,STAT3在早期胚胎发育和骨髓细胞的分化中还发挥着不可缺少的作用。在正常生理状态下,STAT3蛋白的活化处于机体严格调控之下,其激活是快速而短暂的,仅维持数分钟到几小时,对于维持正常细胞的生理功能起着关键性作用。越来越多的研究结果显示,STAT3的持续活化,会使细胞内信号过度放大,并导致细胞的异常增殖和凋亡障碍,最终促进肿瘤的形成、发展。在人类白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织和细胞系中,STAT3异常表达或持续活化,提示STAT3异常表达与肿瘤发生发展密切相关。另外,STAT3异常活化导致的抗炎因子(IL-10、 VEGF、TGF-p)过高是DC和CTL活化分化受阻的关键原因。因此,STAT3已被认为是一种癌基因,是肿瘤治疗的新靶点。microRNA (miRNA)是一类主要在转录后水平上对基因表达进行调节的短片段非编码RNA,是近年来生命科学研究领域的一个焦点。在哺乳动物细胞内,miRNA可通过序列特异性的不完全互补方式抑制靶基因mRNA的翻译。研究发现,与正常组织相比,人类肿瘤组织中miRNA的表达水平以及类型均发生显著改变；此外,许多miRNA改变在肿瘤形成之前即已出现,而非仅仅是发生于肿瘤形成之后的一种继发性改变。在肝脏中,miRNA成分异常或功能失调与肝细胞增殖分化以及原发性肝癌的发生等密切相关。因此,miRNA作为一种新的肿瘤诊断和治疗的靶点,为人类战胜恶性肿瘤开辟了新的思路。本研究以肝癌细胞系HepG2、H7402、PLC/PRF/C为研究对象,通过研究肝癌细胞中异常活化的STAT3信号通路,观察其对NK细胞免疫功能的影响,探讨肿瘤细胞抑制天然免疫功能的分子机制,为STAT3作为肿瘤治疗靶点的应用提供更为详实的理论依据；同时,寻找与肝癌细胞中STAT3信号相关的关键miRNA分子,研究其与STAT3的相互关系,通过干预miRNA的表达水平,探究肝癌细胞中STAT3相关miRNA对天然免疫功能的影响,为肝癌的治疗提供一个新的方向。研究方法：采用阳离子脂质体技术转染STAT3诱骗寡聚核苷酸(decoy ODN),特异性阻断肝癌细胞中过度活化的STAT3,并通过萤光素酶报告基因实验验证STAT3decoy ODN对于STAT3的特异性。随后,利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)掺入实验发现阻断肝癌细胞中STAT3后其对NK细胞的杀伤敏感性增强,流式细胞术证实阻断肝癌细胞中STAT3后其表面杀伤分子相关配体(ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达增加,并通过抗体阻断实验说明ULBP3对STAT3介导的NK细胞的杀伤敏感性改变起关键作用；同时,MTT掺入法检测肝癌细胞培养上清孵育后NK细胞杀伤的能力,发现阻断肝癌细胞中异常活化的STAT3能纠正肿瘤对NK细胞的免疫抑制作用,并凭借实时定量PCR、流式细胞术以及ELISA方法证实阻断STAT3转录活性的肝癌培养上清可以促进NK细胞活化和杀伤相关分子(CD69、NKG2A、NKG2D、FasL、颗粒酶B、Perforin)的表达。此外,实时定量PCR、ELISA方法显示阻断STAT3活化还改变了肝癌细胞分泌的细胞因子谱,尤其是TGF-β1和IL-10表达和分泌的减少,通过萤光素酶报告基因实验证实由于STAT3能够分别作用于TGF-β1和IL-10的启动子调节其转录,导致阻断STAT3活化后肝癌细胞中TGF-β1和IL-10表达降低；中和肝癌上清中TGF-β1能促进NK细胞的杀伤作用,而加入TGF-β1至肿瘤上清中则能抑制NK细胞的杀伤作用。与此同时,我们发现阻断STAT3活化后肝癌细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-y的表达上调,并且Western blot、萤光素酶报告基因实验显示阻断STAT3能够诱导肝癌细胞中STAT1信号通路的活化,加入Ⅰ型干扰素(IFN)至肿瘤上清中能够促进NK细胞的杀伤能力及杀伤相关分子的表达,而阻断肝癌细胞上Ⅰ型干扰素受体(IFNR)则反之。表明TGF-β1和Ⅰ型干扰素在肝癌诱导的NK免疫抑制过程中均发挥重要作用。接下来,利用实时定量PCR方法检测肿瘤细胞中miRNA表达谱的变化,我们发现用decoy ODN特异性阻断STAT3后肝癌细胞中miR-146a表达降低、miR-155表达升高。随后,通过MTT、实时定量PCR以及流式细胞术,我们分别观察了转染miR-146a或miR-155的模拟物或阻遏物对肝癌细胞生物学特征和免疫学相关指标的影响,包括肿瘤细胞的增殖、炎性细胞因子的表达、细胞周期及其对NK细胞杀伤能力的作用。其次,将转染miR-146a阻遏物或miR-155模拟物的小鼠肝癌细胞于皮下荷瘤C57／B6鼠,利用MTT和流式细胞术分别检测肝癌细胞对肝、脾淋巴细胞的杀伤敏感性以及肝脏、脾脏、肿瘤浸润组织、腋窝和腹股沟淋巴结中淋巴细胞的活化和杀伤相关分子表达,进一步确认miR-146a和miR-155的异常表达在肝癌发生发展中起重要作用。同时,染色质免疫共沉淀(ChIP)和萤光素酶报告基因实验证实STAT3能够直接结合miR-146a和miR-155的启动子而靶向调控其表达。然而,用5-杂氮脱氧胞苷(5-Aza,甲基转移酶抑制剂)抑制DNA甲基化后miR-155表达显著升高,进而通过甲基化PCR(MS-PCR)和免疫共沉淀(IP)技术探究在肝癌细胞中甲基化和DNA甲基转移酶(DNMT1)与STAT3调控miR-155表达的影响。研究结果：结果一：阻断肝癌细胞中STAT3可以逆转肿瘤诱导的免疫功能抑制,增强NK细胞功能1阻断肝癌细胞中STAT3能增加肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性利用decoy ODN技术分别阻断人肝癌细胞系HepG2、H7402、PLC/PRF/C中异常活化的STAT3,这些肿瘤细胞对NK-92、NKL或PBMC的杀伤敏感性显著增加。然而,随机对照(scramble ODN)处理不影响肝癌细胞对上述效应细胞的杀伤敏感性。2阻断肝癌细胞中STAT3上调肿瘤细胞表面NKG2D配体表达阻断肝癌细胞中STAT3能够通过上调肿瘤细胞表面NKG2D配体的表达水平,特别是ULBP-3,而增强其对NK细胞的杀伤敏感性。3阻断肝癌细胞中STAT3逆转肿瘤诱导的对NK细胞功能的抑制作用肝癌细胞培养上清对NK细胞杀伤的功能具有抑制作用,然而阻断肝癌细胞中STAT3会逆转这种抑制作用促进NK细胞对肿瘤杀伤。4阻断STAT3转录活性后,肝癌细胞培养上清能够促进NK细胞活化阻断肝癌细胞中STAT3的转录活性,其上清能够显著提高NK细胞中杀伤相关分子的表达,促进NK细胞活化。5阻断STAT3转录活性改变肝癌细胞中炎症细胞因子的表达阻断肿瘤细胞中STAT3的转录活性影响肝癌细胞中炎症细胞因子的表达,下调免疫负调相关的细胞因子(如IL-8、IL-10和TGF-β1),并促进肝癌细胞表达免疫活化因子IFN-α、IFN-β和IFN-γ。6阻断STAT3转录活性后,肝癌细胞中TGF-β1的减少和Ⅰ型干扰素的增加对NK细胞的活化起重要作用利用萤光素酶报告基因实验证实STAT3能够分别作用于TGF-β1和IL-10的启动子调节其转录,导致阻断STAT3活化后肝癌细胞中TGF-β1和IL-10的表达降低；此外,阻断STAT3还能够诱导肝癌细胞中STAT1信号通路的活化。进一步,通过杀伤实验发现中和肝癌上清中TGF-β1或加入Ⅰ型干扰素至肿瘤上清中能促进NK细胞的杀伤作用,而在肿瘤上清中加入TGF-β1或阻断肝癌细胞上Ⅰ型干扰素受体则能抑制NK细胞的杀伤作用,从而说明肝癌细胞中TGF-β1和Ⅰ型干扰素的水平对NK细胞的活化发挥重要作用。结果二：肝癌细胞中STAT3通过表观调控miR-155表达诱导对NK细胞抗肿瘤免疫功能抑制1阻断STAT3转录活性后,肝癌细胞中miR-155的表达增加阻断肝癌细胞中STAT3可以促进肿瘤细胞中miR-155的表达。2miR-155的水平不影响体外培养的肝癌细胞增殖转染miR-155模拟物或阻遏物不影响体外培养肝癌细胞的细胞周期和增殖能力。3miR-155抑制肝癌细胞中与STAT3活化相关的炎症细胞因子表达miR-155抑制促进肝癌细胞中与STAT3活化相关的炎症细胞因子表达,从而参与肿瘤诱导的炎症微环境的产生并促进肿瘤免疫逃逸。4肝癌细胞中miR-155的表达水平影响NK细胞抗HCC功能肝癌细胞中低水平的miR-155可以促进STAT3活化相关的炎症细胞因子表达,从而导致肿瘤诱导的炎症微环境的产生、促进肿瘤免疫逃逸。转染miR-155模拟物,其肝癌细胞上清能够显著提高NK细胞中杀伤相关分子的表达,促进NK细胞活化,增强NK细胞对肿瘤的杀伤作用,逆转肿瘤诱导的NK细胞抑制作用。5肝癌细胞中过表达miR-155可增强NK细胞的体内抗肿瘤作用用转染miR-155模拟物的肝癌细胞皮下荷瘤C57/B6鼠,实验结果显示该荷瘤小鼠肿瘤组织重量明显小于对照荷瘤组,其肝脏、脾脏、肿瘤浸润组织、腋窝和腹股沟淋巴结中淋巴细胞的活化和杀伤相关分子的表达增加,肝癌细胞对此荷瘤小鼠肝、脾淋巴细胞的杀伤敏感性增强,说明在肝癌细胞中过表达miR-155能够增强NK细胞的体内抗肿瘤作用。6STAT3直接结合miR-155的启动子通过ChIP实验说明STAT3能够直接结合miR-155的启动子。7DNA甲基化酶抑制剂可显著升高miR-155的表达5-Aza (DNA甲基转移酶抑制剂)处理肝癌细胞使miR-155表达显著升高8DNA甲基化参与STAT3对miR-155的转录调控通过甲基化PCR(MS-PCR)和萤光素酶报告基因实验证实,在STAT3靶向调控的miR-155启动子中存在DNA甲基化,并且由于miR-155启动子发生甲基化造成了肝癌细胞中miR-155低表达。9DNA甲基转移酶(DNMT1)在肝癌细胞miR-155的甲基化过程中起重要作用ChIP和IP的结果显示：在肝癌细胞中,持续活化的STAT3能够通过招募DNMT1促进miR-155的启动子发生甲基化。结果三：肝癌细胞中STAT3通过调控miR-146a表达诱导肿瘤免疫抑制1阻断肝癌细胞中STAT3能抑制肿瘤细胞中miR-146a的水平并促进miR-146a靶基因的表达阻断STAT3的转录活性后肝癌细胞中miR-146a表达降低,而miR-146a相关靶基因(IFIT3、STAT1和TRAF6)表达增加。2miR-146a的水平不影响体外培养的肝癌细胞增殖转染miR-146a模拟物或阻遏物不影响体外培养肝癌细胞的细胞周期和增殖能力。3miR-146a促进肝癌细胞中与STAT3活化相关的炎症细胞因子表达miR-146a毙够促进肝癌细胞中与STAT3活化相关的炎症细胞因子表达,从而参与肿瘤诱导的炎症微环境的产生并促进肿瘤免疫逃逸。4miR-146a参与肝癌诱导的对NK细胞功能的抑制作用抑制肝癌细胞中miR-146a表达,其上清能够显著提高NK细胞中杀伤相关分子的表达,促进NK细胞活化,增强NK细胞对肿瘤的杀伤作用。5STAT3直接结合miR-146a的启动子并调控miR-146a的转录表达通过ChIP技术证实STAT3能够直接结合miR-146a的启动子,并且萤光素酶报告基因实验说明STAT3可以调控miR-146a的启动转录表达。6抑制肝癌细胞中miR-146a的水平增强NK细胞的体内抗肿瘤作用用转染miR-146a阻遏物的肝癌细胞皮下荷瘤C57/B6鼠,实验结果显示该荷瘤小鼠肿瘤组织重量明显小于对照荷瘤组,其肝脏、脾脏、肿瘤浸润组织、腋窝和腹股沟淋巴结中淋巴细胞的活化和杀伤相关分子表达增加,肝癌细胞对此荷瘤小鼠肝、脾淋巴细胞的杀伤敏感性增强,说明在肝癌细胞中抑制miR-146a能够增强NK细胞的体内抗肿瘤作用。结论：本研究证明,阻断肝癌细胞中STAT3转录活性能够通过逆转肿瘤诱导的免疫抑制来增强NK细胞抗肿瘤作用。一方面,阻断STAT3后不仅引起肝癌细胞高表达NKG2D配体使其对NK细胞的杀伤敏感性增加；另一方面,由于阻断STAT3后肝癌细胞中炎症细胞因子和免疫抑制因子的表达发生改变,如下调TGF-β和IL-10,而Ⅰ型干扰素表达增加,从而逆转肿瘤导致的免疫耐受状态,使NK细胞易于活化,表达高水平的活化和杀伤相关分子,提高NK细胞的杀伤能力。进一步的研究发现,STAT3持续活化还会影响肝癌细胞中microRNA的表达。通过实时定量PCR检测显示阻断STAT3后肝癌细胞中miR-146a表达减少而miR-155表达增加。转染阻遏物或模拟物,抑制肝癌细胞中miR-146a表达或者过表达miR-155均能影响与STAT3活化相关的炎症因子表达,增强NK细胞的活化以及杀伤肿瘤细胞的能力；小鼠体内实验显示,该荷瘤小鼠肿瘤组织重量明显小于对照荷瘤组,其肝脏、脾脏、肿瘤浸润组织、腋窝和腹股沟淋巴结中淋巴细胞的活化和杀伤相关分子的表达增加、杀伤肿瘤细胞的能力增强,说明在肝癌细胞中抑制1miR-146a或者过表达miR-155能够增强NK细胞的体内抗肿瘤作用。进一步,通过ChIP和萤光素酶报告基因实验证明,STAT3能够直接结合1miR-146a的启动子并调控其转录表达；至于STAT3与miR-155的关系,实验结果显示,在STAT3直接结合并调控miR-155起始转录的过程中,肿瘤细胞中过度活化的STAT3还能通过招募DNMT1至miR-155启动子区域导致miR-155由于DNA甲基化而表达缺失。意义：本研究通过检测肝癌细胞中异常活化的STAT3信号通路对NK细胞免疫功能的影响,发现阻断STAT3的转录活性不仅能抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡,还能通过影响肝癌细胞中炎症细胞因子的表达(如TGF-β、IL-10以及Ⅰ型干扰素),改变了肿瘤微环境中NK细胞免疫耐受状态使其易于活化而杀伤肿瘤细胞,从而为STAT3作为肿瘤治疗靶点的应用提供更为详实的理论依据；同时,通过寻找与肝癌细胞中STAT3信号相关的关键miRNA分子,发现肿瘤细胞中miR-146a和miR-155异常表达与STAT3持续活化直接相关,通过干预1miRNA的表达水平,揭示肝癌细胞中失控性表达miR-146a和miR-155均参与肿瘤诱导天然免疫功能的耐受,纠正microRNA的表达则能逆转免疫耐受增强抗肿瘤免疫应答。通过探讨miRNA对天然免疫功能的影响,为肝癌的治疗提供一个新的方向。