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NAC蛋白是植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育过程。本研究以杨树(Populustrichocarpa为研究对象,对NAC基因家族进行系统分析,共鉴定出163个NAC基因家族成员,进化分析显示这些基因被聚类成18个亚家族。结果表明,这些NAC的基因结构和基序组成在亚家族之间具有保守型,有120个NAC基因分布在19个连锁群上,87(73%)个基因定位在杨树基因组的复制区段并且在进化过程中被保留。EST频率和生物芯片分析发现,大部分的杨树NAC基因表达都有时空特异性,但大部分复制基因的表达模式则部分冗余,说明这些基因在进化过程中发生了亚功能化。利用实时定量PCR分析25个候选基因,其表达特异性与预测结果一致。
基于NAC基因的基因组分布,推测大片段重复对杨树NAC基因家族的扩增起主要作用。通过对NAC基因进行系统的表达谱分析,发现了NAC家族成员的功能分化。另外,大片段重复发生以后,基因表达模式差异表明杨树NAC基因通过亚功能化被保留下来。我们的结果为进一步功能鉴定杨树NAC基因以及分析NAC基因结构与功能的关系奠定了基础。
纤维素对根毛顶端细胞壁的完整性起主要作用,但目前对根毛形成过程中根毛顶端的纤维素生物合成相关基因研究甚少。以前的研究表明,拟南芥AtCSLD3参与根毛形成,可能参与纤维素或者类似纤维素的β-葡聚糖的生物合成,为此我们进一步研究其功能并分析鉴定它在杨树中的同源基因。对杨树(30个),拟南芥(29个)和水稻(34个)CSL基因家族成员进行生物信息学分析,发现杨树PdCSLD5和PdCSLD6与AtCSLD3位于同一分支上,蛋白序列比对分析发现PdCSLD5和PdCSLD6与AtCSLD3具有非常高的同源性(86%)。进一步对AtCSLD3、PdCSLD5和PdCSLD6基因结构分析表明,它们都含有三个外显子和两个内含子。推测PdCSLD5和PdCSLD6可能是AtCSLD3的功能同源基因。
通过实时定量PCR和GUS组织化学染色分析发现,PdCSLD5和PdCSLD6基因在所有组织器官中均有表达,但是在根部特别是根毛的表达量最高。亚细胞定位分析发现PdCSLD5和PdCSLD6定位于根毛顶端的质膜,在非根毛细胞中,PdCSLD5和PdCSLD6定位于高尔基体。同时,PdCSLD5和PdCSLD6的定位受到活性氧的调控。
分别克隆PdCSLD5和PdCSLD6基因并构建过表达整体,然后分别互补拟南芥atcsld3突变体。结果显示,PdCSLD6完全互补拟南芥atcsld3突变体的根毛缺陷表型,而PdCSLD5则部分互补atcsld3突变体表型。
细胞壁单糖组成分析表明拟南芥atcsld3突变体中葡萄糖残基含量明显上升,纤维素含量分析表明拟南芥atcsld3突变体的纤维素含量明显降低,并且这些细胞壁糖组分的变化可以被PdCSLD6基因的表达恢复至野生型的水平。多糖免疫定位分析发现,CCRC-M1,CCRC-M87,CCRC-M38和LM10(分别检测木葡聚糖、同型半乳糖醛酸聚糖和木聚糖)四种抗体荧光信号强度在不同的拟南芥株系中没有明显差异,表明AtCSLD3或PdCSLD6可能与上述多糖的生物合成无关。使用CBM3a和CBM17抗体(分别检测纤维素和非结晶化β-葡聚糖)分析时,与野生型相比,CBM3a在atcsld3突变体中的荧光信号明显减弱,相反,CBM17的荧光信号在atcsld3突变体中明显增强,表明在atcsld3细胞壁中纤维素成分显著降低,同时非结晶化的β-葡聚糖成分明显升高;在PdCSLD6互补的atcsld3转基因植株中CBM3a和CBM17的荧光信号均恢复到野生型水平,但在PdCSLD6过表达植株中CBM17的荧光信号较野生型有显著增强,说明在PdCSLD6过表达植株中,非结晶化β-葡聚糖成分明显提高。以上结果证明PdCSLD6和AtCSLD3参与纤维素生物合成,同时表明它们是功能同源基因。