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[目的]脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种严重的中枢神经系统疾病,具有高致残率、高死亡率及高严重并发症发生率等特征,一旦发生,给个人、家庭和社会造成极为沉重的经济负担。在药物治疗方面,甲基强的松龙的使用因其可导致多种严重并发症而饱受争议。课题组前期研究发现,萘莫司他(Nafamostat,NM)可在脊髓损伤后抑制炎症反应,减少胶质瘢痕增生,促进运动功能恢复。而凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,在炎症反应中发挥重要作用,可作为调控脊髓损伤微环境失衡的重要靶点。本课题旨在以前期Nafamostat修复脊髓损伤有效性研究结果为基础,进一步明确Nafamostat修复脊髓损伤的用药时间窗,评估用药安全性,并探讨其在脊髓损伤修复过程中的机制。[方法]1.大鼠运动功能及神经传导功能检测选取8周龄雌性Wistar大鼠,体重220 g±10 g,随机分为3组:假手术组,单纯损伤组和NM组。假手术组仅去除T10椎板;单纯损伤组与NM组制备T10节段脊髓挫伤模型。NM组分为7个亚组,分别在术后7个不同时间点(0h,2 h,8h,12 h,24 h,48 h,5d)开始干预。术后采用BBB评分评价大鼠运动功能恢复情况;通过神经电生理检测感觉诱发电位(Sensory Evoked Potential,SEP)和运动诱发电位(Motor Evoked Potential,MEP)评价其神经功能恢复情况;2.大鼠凝血功能检测选取8周龄雌性Wistar大鼠,体重220 g±10 g,随机分为3组:假手术组,单纯损伤组和NM组。假手术组仅去除T10椎板;单纯损伤组与NM组制备T10节段脊髓挫伤模型。NM组分为5个亚组,分别在手术后5个不同时间点(0 h,2 h,8 h,12 h,24 h)开始干预。分别在损伤后2 h和24 h取静脉血与脊髓组织,通过凝血功能检测和Western blot评价Nafamostat修复脊髓损伤的安全性。3.Nafamostat修复大鼠脊髓损伤机制研究选取8周龄雌性Wistar大鼠,体重220 g±10 g,随机分为3组:假手术组,单纯损伤组和NM组。假手术组仅去除T10椎板;单纯损伤组与NM组制备T10节段脊髓挫伤模型。NM组在术后选取最佳用药时间点开始干预。运用免疫荧光染色检测脊髓组织中Thrombin的表达;通过Western blot检测脊髓组织凝血酶作用途径信号蛋白(Thrombin、PAR1、STAT3、p-STAT3)表达;通过 Western blot检测星形胶质细胞前体标志物Vimentin的表达,以及运用免疫荧光染色检测脊髓组织中星形胶质细胞的活化情况;采用炎症芯片技术检测炎症因子表达变化。[结果]1.Nafamostat修复脊髓损伤用药时间窗为损伤后8-12 h在大鼠脊髓损伤前后利用BBB评分评估运动功能的恢复。持续5 w实验结果显示,脊髓损伤后0 h-24 h开始用药的NM组大鼠,后肢运动功能恢复较单纯损伤组更好,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中,损伤后8 h及12h NM组大鼠后肢运动功能恢复优于其他NM组和单纯损伤组,差异具有统计学意义(P<0.05)。脊髓损伤后5 w行神经电生理检测。结果显示,单纯损伤组与NM组MEP与SEP潜伏期较假手术组均有不同程度延长,8 h与12 h NM组潜伏期延长时间较其余NM组缩短,差异具有统计学意义(P<0.05);单纯损伤组与NM组大鼠MEP与SEP波幅较假手术组均有不同程度下降,8 h与12 h NM组波幅降低程度较其余NM组更小,且差异具有统计学意义(P<0.05)。2.脊髓损伤后8 h开始进行Nafamostat干预对凝血功能无显著影响凝血功能(PT、PT活动度、PT-INR等)的检测结果表明,在各NM组中,脊髓损伤后8 h开始给药的NM组凝血功能基本与单纯损伤组一致,差异无统计学意义。3.Nafamostat 介导 Thrombin-PAR1-STAT3 通路修复脊髓损伤Western blot结果显示,NM组脊髓组织中凝血酶表达明显低于单纯损伤组;免疫荧光结果显示,单纯损伤组损伤脊髓局部组织中Thrombin+神经元数量较NM组增多,差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,NM组中Thrombin,PAR1,STAT3,p-STAT3及Vimentin的表达均较单纯损伤组降低,差异具有统计学意义(P<0.05);在损伤5 w进行免疫荧光检测,NM组脊髓组织中GFAP+星形胶质细胞数较单纯损伤组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);炎症芯片结果显示,脊髓损伤后Nafamostat干预可降低多种促炎因子表达。[结论]1.应用Nafamostat修复大鼠脊髓损伤的用药时间窗为损伤后8 h-12 h,时间窗较甲强龙更宽,更具临床转化意义;2.在脊髓损伤后8 h开始进行Nafamostat干预对机体凝血功能无显著影响,用药安全性较好,进一步佐证用药时间窗的合理性;3.脊髓损伤后,Nafamostat可降低损伤组织局部Thrombin的表达及活性,抑制其对PAR1的激活,干扰下游STAT3信号通路传递,降低星形胶质细胞增殖活化,减少胶质瘢痕增生,降低炎症反应,修复脊髓损伤。