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研究背景:近50年以来,人类的平均寿命已得到显著提高,但是生殖健康总体水平却呈现出下降的趋势。根据文献的统计分析,从1973到2011年,全球男性精子总数和密度分别降低约5.33×106个/年和0.7×106/m L.年[1-2];同时临床上各种男性生殖疾病的发病率也在逐渐增加[3-4]。已有的研究表明,基因与环境交互作用是造成男性生殖功能损伤尤其是生精障碍等不孕不育的重要原因之一[5]。其中,邻苯二甲酸酯（PAEs）是人类体液中最常被检出的环境有机污染物,其中又以邻苯二甲酸二丁酯（DBP）为代表受到广泛研究。目前的研究表明,DBP可以诱导雄性生殖损害,DBP暴露后导致睾丸生精细胞早熟脱落和精子数量下降,具有支持、营养和保护生精细胞功能的支持细胞内蛋白骨架解聚是生精细胞早熟脱落的重要节点[6-10]。尽管DBP生殖发育毒性已有大量的研究报道,但其分子机制还未充分阐明。SOX蛋白是一类基因转录调控分子,在生殖细胞的发生、分化和成熟等过程中起重要的调控作用,同时也参与了包括癌症在内的众多疾的发生[11,12]。SOX30基因是最近发现的SOX家族成员,本课题组前期也首次报道,在成体小鼠睾丸中SOX30基因低甲基化而高水平表达,推测SOX30可能在维持正常的雄性生殖功能方面具有重要作用[13]。最新的国内外一些报道也表明SOX30基因是精子形成所必需的,与睾丸发育紧密相关[14-16],但是SOX30基因在生殖系统发育中的功能和机制尚不清楚。此外,在前期研究中,我们发现DBP处理诱导的睾丸病理损伤和生精过程中,SOX30基因表达发生改变,提示SOX30可能在DBP诱导的雄性生殖损伤中发挥作用,但是二者的应答作用和机制还需实验证实。本研究拟通过SOX30基因敲除小鼠模型,分析不同基因型雄性小鼠的各脏器组织的病理特征,评价SOX30在生殖发育中的潜在作用。其次,通过DBP诱导的TM4细胞体外损伤模型及SOX30差异表达TM4细胞模型,探讨SOX30在DBP诱导的TM4细胞增殖抑制中的作用和分子机制。研究方法:1.SOX30基因敲除对雄性小鼠各重要脏器组织形态及生殖功能的影响通过基因重组构建SOX30基因敲除小鼠并进行PCR鉴定基因型,称重各脏器质量并计算脏器指数（包括心、肝、脾、肺、肾、大脑、胸腺、睾丸、附睾和骨髓）,显微观察不同基因型小鼠各脏器组织结构和形态特征,分析SOX30基因敲除对小鼠各脏器发育的作用。重点观察睾丸、附睾组织形态及附睾精子数目,检测睾丸组织激素水平,分析SOX30对生殖功能的影响。2.SOX30在DBP致TM4细胞增殖抑制中的作用及机制体外构建DBP诱导TM4细胞损伤模型,通过CCK8法分析DBP染毒对TM4细胞形态及增殖的影响,流式细胞术（FCM）检测DBP染毒后TM4细胞周期的变化,PCR及WB检测周期相关分子蛋白。通过慢病毒感染和si RNA干扰技术构建SOX30差异表达TM4细胞模型,并采用通过FCM、WB和PCR法分别检测SOX30差异表达后TM4细胞周期及相关分子的表达变化。在此基础上,采用FCM法检测DBP处理及SOX30干扰后TM4细胞周期变化,验证DBP通过调控SOX30表达诱导TM4细胞周期阻滞的作用及机制。研究结果:1.SOX30基因敲除可导致雄性小鼠部分脏器病理损伤及生精障碍（1）野生型（WW）、杂合型（KW）和纯合型（KK）雄性小鼠体质量之间未见差异（P>0.05）;KK组小鼠睾丸脏器指数较WW和KW组明显降低（P<0.05）;提示SOX30基因敲除影响雄性小鼠睾丸发育。（2）显微观察一般脏器组织病理形态特征发现,与WW组和KW组比较,KK组雄性小鼠的部分脏器结构和形态发生改变:?大脑神经元及胶质细胞数量减少,胶质纤维结节形成;?肝细胞显著增生;?脾脏红髓增生;（4）骨髓巨核成簇伴小梁旁异常分布。结果提示:SOX30敲除可潜在影响大脑、肝脏、脾脏发育和造血细胞分化。（3）通过对不同基因型雄性小鼠性腺病理形态观察发现,与WW组和KW组比较,KK组雄性小鼠睾丸组织体积和曲细精管直径变小（P<0.05）,曲细精管内生精细胞脱落,可见空泡变性和巨细胞,管腔中央无梭形精细胞;KK组附睾病理和精子涂片中未见精子,提示SOX30敲除可导致小鼠生精障碍。通过ELISA法检测3组基因型雄性小鼠睾丸组织中T和INH-B的水平,结果发现:与WW和KW组比较,KK组小鼠睾丸组织匀浆中T和INH-B显著下降（P<0.05）。表明敲除SOX30可影响小鼠睾丸T和INH-B合成分泌。2.SOX30基因参与DBP诱导的TM4细胞增殖抑制（1）DBP处理可诱导TM4细胞G1期阻滞通过CCK8法实验发现DBP暴露下可显著抑制TM4细胞增殖,且与DBP暴露诱导TM4细胞G1期阻滞有关;PCR检测发现DBP处理后细胞周期调控分子CDK2、CDK6下降,SOX30表达量明显上调（P<0.05）。提示DBP处理可诱导TM4细胞G1期阻滞,SOX30、CDK2、CDK6等是候选的调控分子之一。（2）干扰SOX30基因表达可部分恢复DBP诱导的TM4细胞G1期阻滞利用慢病毒感染构建的SOX30过表达TM4细胞模型,发现SOX30过表达可诱导细胞G1期阻滞。PCR和WB验证发现SOX30过表达后细胞周期相关调控分子CDK2和CDK6降低。同时,在si RNA转染的SOX30敲低细胞模型中,我们发现DBP暴露诱导的TM4细胞G1期能够部分恢复,细胞周期分子CDK2和CDK6的表达也显著升高,进一步证实SOX30参与了DBP诱导的TM4细胞G1期阻滞,且CDK2和CDK6是SOX30发挥调控作用的重要分子。结论:1.SOX30敲除可导致小鼠大脑、肝脏、脾脏出现病理损伤,并导致骨髓造血细胞分化发育异常,提示SOX30基因可能在大脑、脾脏和骨髓造血中具有重要的调控作用,可能参与多种脏器的功能调节。2.SOX30敲除可导致小鼠睾丸组织病理损伤、睾丸T和INH-B激素合成分泌异常并导致精子生成障碍,提示SOX30基因在小鼠睾丸发育及生精过程中具有重要作用,3.SOX30参与调控DBP诱导的TM4细胞G1期阻滞,CDK2和CDK6是SOX30参与调控通路中的重要下游分子。