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传统观点认为,神经元不能分裂,但在我们实验室以往的工作中观察到,多种来源的成熟神经元可以分裂,并且用连续摄影的方法捕捉到处于有丝分裂各个时相的分裂神经元,进一步用多种生物学技术,证明处于分裂的神经元具有典型成熟神经元才具有的各种特征。这说明,神经元分裂现象在神经系统中具有普遍意义。神经元为什么会脱离细胞周期?为什么在一定条件下又可以分裂?探讨其中的分子机理具有重要的生物学意义。本文从研究两个结构相似但功能却相对的分子Mage-H1和Mage-D1入手,探讨两者在细胞周期、细胞增殖和分化调控中的可能作用,从而为阐释神经元脱离细胞周期的分子机制奠定基础。在深入研究之前,我们首先对Mage-H1和Mage-D1的优势抗原表位进行预测。对Mage-D1蛋白的N端53aa-295aa进行了原核表达并制备了针对Mage-D1蛋白的抗体,为深入研究其功能奠定基础。(关于Mage-H1的抗体制备部分将会在我们实验室的另一位硕士生的论文中阐述。)本研究发现,在诱导分化后的PC12细胞,Mage-H1表达上调,与此同时,Mage-D1的表达却下调了。这说明,Mage-H1可能参与PC12细胞分化,维持细胞的静息期中发挥重要功能;而Mage-D1可能在促进PC12细胞增殖,维持细胞的去分化状态上发挥重要功能。随后,我们将能表达带有GFP-tag的Mage-H1的质粒转染PC12细胞,发现部分表达Mage-H1的PC12细胞发生了分化。流式细胞技术分析表明,Mage-H1的瞬时过表达对PC12细胞有明显的G0-G1期阻滞。Western-blot检测发现,PC12细胞在转染Mage-H1 cDNA24hrs之后,Cdk2即表达下调,而且此下调可以持续72hrs以上。此外,我们用G418筛选得到能稳定表达外源性的Mage-H1的PC12细胞克隆。流式细胞技术分析表明,与native PC12相比,稳定表达Mage-H1的PC12细胞克隆也有明显的G0-G1期阻滞现象。而且,稳定表达Mage-H1的PC12细胞克隆经NGF诱导更容易分化为神经元。在酵母双杂交筛选实验中,我们找到Mage-D1的相互作用蛋白Rit2。Rit2的活性形式能通过ERK和p38 MAPK途径促进PC12细胞的分化。我们推测,Mage-D1可能通过抑制Rit2的活性,使PC12细胞处于去分化的状态。