肝胆湿热动物模型的建立和龙胆泻肝丸治疗肝胆湿热的机理研究肝胆湿热为中医常见证候之一，为湿热蕴结肝胆，使肝胆疏泄失常所致，所涉及现代医学的病种大多数是肝胆系疾病，临床上主要表现身目黄疸，胁肋痛。从现代医学的观点来看，身目黄疸是由于胆汁淤积所致。肝内胆汁淤积(intra-haptic cholistasis，IC)是许多肝病共有的基础病变。虽然传统中医学没有肝内胆汁淤积与之相应的明确病名，但根据其临床症状和体征，应当归属于中医学“黄疸”、“积聚”、“臌胀”等病范畴。湿、热、瘀为其基本病因病机，为肝胆疏泄失常所致。合适的动物模型是进行疾病发病机理、药物筛选、药效评价及其作用机理研究的重要工具。然而，由于目前缺乏理想的肝胆湿热动物模型，使得有关肝胆湿热的病因病机研究以及治疗肝胆湿热药物的筛选、效果评价以及作用机理研究具有很大的困难。中医临床肝胆湿热常有身目黄疸的客观表现，从现代医学的观点来看，身目黄疸是由于胆汁淤积所致。因此肝胆湿热与现代医学中的胆汁淤积有相似之处，故以诱导胆汁淤积的发生作为建立肝胆湿热模型具有可能性。肝细胞和胆小管细胞膜上具有胆汁成分转运分子，它们与胆汁的形成和分泌有关。各种淤胆性肝损害时，肝细胞膜窦面或胆管面转运体蛋白分子的表达或功能将会受到不同的影响，多药耐药蛋白(MDR)和多药耐药相关蛋白(MRP)是两类与胆汁转运功能密切相关的蛋白。近年来的研究表明，MDR或MRP基因缺陷可能与某些淤胆形成有关。α-萘异硫氰酸酯(ANIT)在动物体内可转化为有肝毒性的代谢产物产生肝毒性，其诱发动物肝损伤的生物化学和病理形态学改变与人类肝内胆汁淤积病变相似。龙胆泻肝丸(LD)由龙胆、柴胡、黄芩、栀子、泽泻、木通、车前子、当归、地黄、炙甘草组成。具有清肝胆，利湿热的功用，是临床治疗肝胆湿热证的代表方之一。长期以来，其在临床上治疗肝胆湿热的效果得到公认，但是，对其作用机理未见深入的研究，因此，其治疗肝胆湿热的作用机理尚不清楚。本研究将根据中医临床肝胆湿热的主要客观表现，参考现代医学的胆汁淤积的形成机理，建立模拟肝胆湿热的动物模型，并对该模型的发病机理进行探讨。在该模型的基础上研究龙胆泻肝丸的治疗肝胆湿热的作用及其机理。目的：首先采用ANIT建立模拟中医临床的肝胆湿热模型，探讨该模型在胆汁转运代谢方面的分子机制。以该模型为基础，观察龙胆泻肝丸治疗肝胆湿热的作用机理，探讨作用靶点，从而为龙胆泻肝丸治疗肝胆湿热提供科学依据。方法：实验一、大鼠肝胆湿热模型的建立将10只大鼠分为对照组和模型组，每组5只。模型组按100mg／kg的剂量一次性灌胃给予α-萘异硫氰酸酯(ANIT)花生油，对照组灌胃同体积花生油。造模后72h，大鼠一一行胆管插管术。收集4 h内的胆汁，按照收集的时间段计算胆汁分泌量。造模后76h检测血清总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆固醇(CHO)水平以及肝组织病理变化。此外，将另外5只大鼠分别于灌胃ANIT后12h、24h、48h、72h、96h分别处死一只。另取1只作为正常对照。分别于不同时间点，取出肝脏，提取肝组织总RNA，用RT-PCR方法检测MDR1b及MRP2 mRNA的表达。实验二、观察龙胆泻肝丸(LD)对肝胆湿热模型大鼠和小鼠的清利肝胆作用将72只大鼠分为6组，分别为对照组，模型组，胆乐胶囊(DL)组和LD 10、5.0、2.5g生药／kg剂量组。LD各剂量组和DL组每日给药1次，连续给药8天。对照组灌胃同体积花生油。于给药期间的第5天，除了对照组外，其余各组在给药后间隔1 h再灌胃给予ANIT 100 mg／kg(仅一次)。于第8天末次给药后30 min(末次给药前禁食24 h，不禁水)，行胆管插管，收集4 h内的胆汁，按照收集的时间段计算胆汁分泌量。并检测血清AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、CHO、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平以及肝组织病理变化。另外72只小鼠按同样方法复制模型，最后检测血清TBIL、DBIL水平。实验三、观察龙胆泻肝丸对肝胆湿热大鼠MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2表达的影响将20只大鼠分为4组，分别为对照组、模型组、LD 5.0、2.5 g生药／kg剂量组。给药组均于动物处死前8天开始给药，每日灌胃给药1次，连续8天。对照组和模型组灌胃同体积的蒸馏水。其中第5天给药1h后，除对照组给予花生油灌胃外，其他各组大鼠按100mg／kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天取出肝脏。提取总RNA，RT-PCR检测MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2 mRNA的表达。实验四、观察龙胆泻肝丸对肝胆湿热大鼠中性粒细胞CD18表达的影响将20只大鼠分为4组，分别为对照组、模型组、LD 5.0、2.5 g生药／kg。给药组均于动物处死前8天开始给药，每日灌胃给药1次，连续8天。对照组和模型组灌胃同体积的蒸馏水。其中第5天给药1h后，除对照组花生油灌胃外，其他各组大鼠按100mg／kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天眼眶静脉取100μl抗凝血，加入PE标记的CD18抗体，流式细胞仪测中性粒细胞CD18表达，另取血20μl血细胞计数仪测白细胞及粒细胞总数。结果：实验一：大鼠肝胆湿热模型的建立结果显示，模型组给予ANIT 72h后，大鼠胆汁分泌量在胆管插管后4h内一直显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)，而血清TBIL、DBIL、CHO、ALT、AST、ALP水平明显高于对照组。组织形态学观察可见模型组出现肝细胞坏死和胆管损伤。对照组大鼠MDR1b mRNA无明显表达，MRP2 mRNA只有较弱表达。模型组大鼠在造模后48h～96h，MDR1b mRNA表达明显增强，但在造模后24h内表达不明显。造模后12h、24h，MRP2 mRNA表达较弱，而在造模后48h～96h均表达明显。实验二：龙胆泻肝丸(LD)对肝胆湿热模型大鼠和小鼠的清利肝胆作用1．胆汁分泌结果显示，模型组的胆汁分泌量较对照组显著降低(P<0.05)。LD各给药组胆汁分泌量不同程度地高于模型组。LD 5.0g生药／kg组、LD2.5g生药／kg组在1h和1.5h时间点的胆汁排泌量较模型组显著增高(P<0.05)，其它时间点也有增高趋势，但无统计学意义。2．血清TBIL、DBIL、CHO水平模型组大鼠血清TBIL、DBIL、CHO水平均上升，与对照组比较有明显差异(P<0.01)。而LD 5.0g生药／kg组、LD2.5g生药／kg组血清TBIL、DBIL、CHO与模型组比较有降低趋势，但无统计学意义。3．血清ALT、AST、ALP模型组大鼠血清ALT、AST、ALP升高，与对照组比较有明显差异(P<0.01)。LD各剂量组的血清ALT、AST、ALP水平均与模型组比较无差异。4．血清MDA、SOD、GSH水平模型组大鼠血清MDA水平升高(与对照组比较P<0.01)，血清SOD及GSH水平与对照组比较无明显变化。LD各剂量组血清SOD、GSH水平与模型组比较无明显差异。LD对血清MDA有降低趋势(与对照组比较P>0.05)。5．肝脏组织形态学各给药组肝细胞坏死不同程度的轻于模型组，其中LD 2.5g生药／kg组分别与模型组相比差异显著(P<0.01)。实验三：龙胆泻肝丸对肝胆湿热大鼠MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2表达的影响1．肝组织MDR1a、MDR1b、MDR 2 mRNA表达模型组大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，肝组织MDR1a、MDR1b mRNA表达显著增加(P<0.05，P<0.01)。MDR2 mRNA也增加，但未达统计学意义。LD 5.0g生药／kg和LD 2.5g生药／kg对肝胆湿热模型大鼠的肝组织MDR1a、MDR1b、MDR2 mRNA表达无明显影响。2．肝组织MRP1 mRNA和MRP2 mRNA表达模型组大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，MRP2 mRNA表达下降，但与对照组相比无统计学意义。MRP1 mRNA的表达未见明显变化(P>0.05)。LD 5.0g生药／kg和LD 2.5g生药／kg对肝胆湿热模型大鼠的肝组织MRP1、MRP2 mRNA表达无明显影响。实验四：龙胆泻肝丸对肝胆湿热大鼠中性粒细胞CD18表达的影响结果显示，LD各给药组白细胞总数以及粒细胞总数有下降趋势，CD18荧光强度明显低于模型组。结论：通过以上实验，我们认为，通过灌胃ANIT，所建立的模型具有肝内、体内胆汁淤积，肝酶水平增高，肝细胞损伤等病理生理特征，与中医临床上以身目黄疸为主要表现的肝胆湿热证类似，可以作为肝胆湿热模型。该模型的肝脏组织中MDR及MRP mRNA表达发生变化，而MDR及MRP是与胆汁转运代谢有关的分子。说明MDR及MRP参与该肝胆湿热模型的形成。龙胆泻肝丸能增加胆汁流量，加速胆汁排出，但是对胆汁转运代谢分子MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2等均无显著影响。结果提示，龙胆泻肝丸治疗肝胆湿热的作用机制可能与增加毛细胆管胆汁流量、减轻脂质过氧化反应、稳定细胞膜、阻抑CD11／CD18介导的中性粒细胞-内皮细胞粘附有关。