论文部分内容阅读
营养期杀虫蛋白(VIPs)是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)在营养生长阶段产生并分泌到胞外的Bt杀虫蛋白。Vip3A与Cry毒素氨基酸同源性低,杀虫谱和作用靶标等也不相同,在害虫防治和抗性治理方面表现出广阔的应用前景。但Vip3A蛋白杀虫机制还不明确,需要进一步深入研究。前期本实验室克隆鉴定出两种新型Bt杀虫基因,其编码的蛋白Vip3Aa60对甜菜夜蛾具有高毒力,而Vip3Ad5表现为无杀虫活性。本文以这两种蛋白为实验材料,研究Vip3A的杀虫机制。主要研究结果如下:(1)利用生物信息学分析发现195KVKK198是Vip3Aa60原毒素潜在的胰酶活化位点,与核心毒素的产生有关。利用N端测序鉴定出Vip3Aa60原毒素的中肠液活化位点是Lys198,为胰酶活化位点。通过蛋白酶抑制剂实验等证明胰酶是Vip3Aa60的主要活化酶。为了进一步探究Vip3Aa60的活化特性,构建了 4个胰酶活化位点的突变体(KKK195197198AAA,KK197198AA,KK195198AA 和KK1951971AA)。对比Vip3Aa60原毒素的活化和对甜菜夜蛾的生物活性发现,当保留Vip3Aa60蛋白第195、197、和198位赖氨酸中的任何一个位点,其原毒素的活化和对甜菜夜蛾的杀虫活性都没有改变;只有3个位点都突变掉后,原毒素不能被胰酶活化产生活化毒素片段,中肠液活化速率变慢且杀虫活性略有降低。这种具有3个胰酶活化位点的特性,使得Vip3Aa60原毒素在昆虫中肠中能被更高效的活化,进而发挥杀虫毒力。但当胰酶不能活化Vip3Aa60原毒素时,昆虫仍可以通过其他方式活化Vip3Aa60原毒素,但活化效率和杀虫毒力都有所下降。(2)Vip3Ad5与Vip3Aa60氨基酸序列相似性达85%,氨基酸差异主要存在于C端活化毒素区域,而活化毒素对于受体结合和毒力的发挥具有重要作用。Vip3Ad5原毒素的活化位点与Vip3Aa60活化位点一致,但活化毒素稳定性实验显示Vip3Aa60活化毒素很稳定,而Vip3Ad5活化毒素不稳定,会随着活化时间的延长被中肠液进一步降解。说明活化毒素的稳定性可能与Vip3A毒性的发挥有关。受体结合实验表明Vip3Aa60和Vip3Ad5均可以结合甜菜夜蛾BBMV受体,并且可以结合相同位点。但Vip3Aa60与受体的解离常数仅为Vip3Ad5的6%。即Vip3Aa60与中肠受体的亲合力更强。说明活化毒素与受体结合的亲和力可能与Vip3A毒力发挥有关。Vip3A蛋白对靶标昆虫杀虫机制的研究有利于Vip3A毒素的推广应用。本研究通过活化和受体结合两个方面进行探究Vip3A蛋白的杀虫机制,确定Vip3A原毒素的活化位点及Vip3Ad没有杀虫毒力的原因,为解析其作用机理奠定基础。