细胞程序性死亡(PCD)是指在生物体中由基因调控的、自主发生的、有序的细胞死亡现象。禾谷类作物糊粉层PCD在种子萌发中起着至关重要的作用。研究发现,H2O2和液泡加工酶(VPE)均影响糊粉层细胞液泡化进程及PCD。本研究以水稻(Oryza sativaL.)“博II优767”种子为实验材料,通过药理学、生物化学、细胞形态学和分子生物学等手段,并结合显微技术,探究内源H2O2和OsVPE3调节水稻糊粉层PCD发生的机制。结果表明:(1)糊粉层是水稻种子产生H2O2和02-的主要部位,NADPH氧化酶抑制剂DPI和H2O2清除剂DMTU都可抑制或清除H202和O2-的产生,且DPI的抑制效应更为显著。(2)DPI和DMTU可明显延缓糊粉层细胞液泡化进程。随着处理浓度升高,液泡化进程变慢,即呈现出一定的浓度效应,其中DPI的延缓效应更明显。(3)DPI和DMTU显著抑制萌发水稻种子的胚根和胚芽的生长,尤其是DPI对胚根生长的抑制作用更为显著。(4)通过研究与水稻种子萌发相关的9个OsNOXs基因的表达量,发现萌发水稻种子中OsNOX2、OsNOX5、OsNOX7、OsNOX8和OsNOX9相对基因表达水平较高,并且,在糊粉层中,OsNOX8是唯一表达量升高的OsNOX基因,因此,推测OsNOX8可能与糊粉层PCD的发生相关。(5)DPI和DMTU通过下调糊粉层中OsNOX8的基因表达水平,以此降低细胞内H2O2的含量,从而推迟糊粉层PCD的进程,其中DPI的抑制效应更为显著。(6)外源H2O2显著诱导OsNOX8的基因表达水平和内源H2O2的产生,促进糊粉层PCD的发生;当DPI和DMTU分别与外源H2O2共处理后,有效地逆转外源H2O2的效应;与DMUT+H2O2处理相比,DPI+H2O2处理逆转外源H2O2的效应更显著。(7)GA通过诱导OsNOX8的基因表达和H2O2的产生,促进糊粉层PCD进程,且促进作用可被DPI有效逆转。因此,GA诱导的OsNOX8可通过调节糊粉层细胞内H2O2的产生,进而影响PCD的发生。(8)DPI和VPE抑制剂Ac-YVAD-CMK均可显著抑制水稻糊粉层细胞内H2O2的产生,且在VPE抑制剂中加入DPI的抑制效果更为显著,并延缓糊粉层PCD的发生,暗示OsVPE3可能通过诱导H2O2的产生,进一步调节PCD。(9)DPI和VPE抑制剂Ac-YVAD-CMK均可显著抑制水稻糊粉层Os VPE3的基因表达水平及VPE的活性水平,且在DPI中加入VPE抑制剂的抑制效果更为显著,并推迟糊粉层PCD的发生,暗示通过NADPH氧化酶途径产生的H2O2可能通过上调OsVPE3,从而实现对PCD的调节。(10)GA上调OsVPE3基因表达水平及VPE活性水平,且上调效应分别被DPI和Ac-YVAD-CMK 所逆转。综上所述,水稻种子正常萌发需要内源H2O2的参与,由NADPH氧化酶途径产生的H2O2在调控水稻种子萌发中起着关键的作用。GA诱导糊粉层OsNOX8和Os VPE3的上调,并且通过NADPH氧化酶途径产生的H202与Os VPE3协同调控水稻糊粉层PCD的进程。