背景与目的:胃癌是世界范围内发病率排名第五、死亡率排名第三的恶性肿瘤,约一半的胃癌新发及死亡病例均发生在我国,造成了很大的疾病负担。肠型胃癌（占胃癌绝大多数）的发生是多因素、多步骤的过程,幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染,宿主因素,环境因素三者共同决定癌变进展。H.pylori感染被认为是胃黏膜癌变进程启动因素,最新共识认为在胃黏膜萎缩/肠上皮化生前根除H.pylori可逆转胃黏膜癌变、甚至消除胃癌发生可能。胃黏膜萎缩/肠上皮化生后,胃内环境不适宜H.pylori定植,胃内H.pylori定植相对减少,非H.pylori细菌定植相对增加,紊乱的胃内菌群在随后癌变过程中起重要作用。越来越多研究表明除H.pylori外,胃内数量众多的细菌参与胃黏膜病变。我们的研究发现相较于胃炎患者,胃癌患者胃黏膜厌氧消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius,P.anaerobius）丰度显著升高,提示其可能参与胃黏膜癌变。但P.anaerobius在胃黏膜癌变中的作用仍不明确。Toll样受体家族是机体识别各种微生物致病成份的主要受体。这些受体分布于细胞表面（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6）或细胞内（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9）,如内质网、溶酶体。TLRs家族不同的细胞亚定位与其识别配体的大分子性质相对应:识别细菌配体的TLRs在细胞膜上表达,而识别病毒核酸的TLRs定位于细胞内。当TLRs被激活时,可通过LTRs共有的下游Myd88依赖途径以及TLR3、TLR4特有的TRIF依赖途径启动细胞内信号转导的级联反应,激活下游信号通路。新近发现P.anaerobius可通过激活TLR2/4,诱导肠上皮细胞产生ROS,促进肠上皮细胞增殖,参与肠黏膜恶性转化过程。NF-κB信号通路是TLRs活化后下游信号通路的枢纽,包括5个转录因子:P65（Rel A）、Rel B、C-Rel、P50（前体P105）、P52（前体P100）。在未激活时,NF-κB在胞质中形成二聚体（主要为P65和P50）被IκB隔离在细胞质中。TLRs信号通路可通过活化IKK激酶激活NF-κB信号通路,活化的IKKβ诱导IκB蛋白磷酸化,导致IκB泛素化及其随后的降解,NF-κB二聚体进而从细胞质抑制中释放,易位到细胞核并驱动靶基因的转录。作为一种可能的胃内致病菌,P.anaerobius在胃黏膜癌变过程有何作用,其能否激活胃黏膜TLRs和下游的NF-κB信号通路介导胃内病变,这些值得深入探讨。本课题拟采用人体胃黏膜样本、转基因动物、细胞三个层面的实验明确:P.anaerobius是否在胃黏膜癌变过程丰度增加;P.anaerobius能否在体内外发挥促癌作用;P.anaerobius致病机制如何、TLRs、NF-κB信号通路在其致病中有何作用。明确以上问题,可为菌群参与胃癌发生提供新的证据以及为胃癌防控提供新的思路。材料与方法:（一）胃炎、肠化、胃癌患者P.anaerobius丰度变化1.收集不同病变阶段（胃炎、肠化、胃癌）患者胃黏膜样本,提取DNA行16S r RNA测序检测胃黏膜菌群,LEFSe分析检测胃炎、胃癌患者胃黏膜显著差异细菌;2.收集胃炎、肠化、胃癌患者胃黏膜组织蜡块,对切片行FISH实验检测胃炎、肠化、胃癌患者胃黏膜P.anaerobius定植情况。（二）P.anaerobius对胃上皮细胞生物学行为的影响构建P.anaerobius感染胃上皮细胞AGS模型,行以下实验:1.制作电镜样本,电镜下观察P.anaerobius对细胞的直接作用;2.CCK-8、EDU实验检测P.anaerobius对细胞增殖的影响;3.检测P.anaerobius对细胞克隆形成的影响;4.检测P.anaerobius对细胞侵袭、迁移、划痕愈合的影响;5.q RT-PCR实验检测P.anaerobius对细胞炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、IL-18）表达的影响。（三）P.anaerobius通过TLR4/TRIF/NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症构建P.anaerobius与胃上皮细胞AGS、GES-1共培养模型,行以下实验:1.提取AGS、GES-1细胞m RNA,行转录组测序,分析P.anaerobius感染相关差异基因,行差异基因KEGG通路富集分析;2.提取AGS细胞蛋白,Western blot检测细胞NF-κB信号通路关键蛋白（p-P65（Ser536）、P65、IKK、p-IKK（Ser176/180）、IκBα）表达,免疫荧光实验检测P.anaerobius感染后AGS细胞P65入核情况;3.提取AGS细胞m RNA,q RT-PCR检测NF-κB信号通路上游TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5）及TRIF、Myd88表达,Western blot检测以上分子蛋白表达;4.转染TLR4 si RNA抑制AGS细胞TLR4表达,Western blot检测抑制TLR4后,P.anaerobius感染对细胞NF-κB信号通路关键蛋白（p-P65（Ser536）、P65、IKK、p-IKK（Ser176/180）、IκBα）及TLR4、TRIF、Myd88蛋白表达变化;5.分别使用TLR4 si RNA、TLR4抑制剂TAK-242及TRIF si RNA抑制细胞TLR4、TRIF表达,q RT-PCR检测抑制TLR4、TRIF表达后,P.anaerobius感染对细胞炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、IL-18）表达变化;6.构建FLAG与目的基因TLR4融合质粒,构建P.anaerobius与TLR4过表达细胞共培养模型。使用FLAG抗体行外源性免疫共沉淀（IP）实验下拉与TLR4结合的细菌蛋白并行质谱分析鉴定蛋白成分。（四）P.anaerobius感染对INS-GAS小鼠胃黏膜病变的影响P.anaerobius菌隔天灌胃3个月构建P.anaerobius感染INS-GAS小鼠模型,灌胃结束后1个月处死小鼠,收集小鼠粪便、胃黏膜样本,行以下实验:1.PCR实验、FISH实验检测P.anaerobius菌定植;2.H＆E染色检测胃黏膜病变、阿尔新蓝-核固红染色检测胃黏膜化生情况;3.免疫组化检测小鼠胃黏膜CD45、Ki67表达;4.q RT-PCR检测小鼠胃黏膜炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、IL-18）表达;5.Western blot、免疫组化、免疫荧光实验检测P.anaerobius感染INS-GAS小鼠胃黏膜NF-κB信号通路关键蛋白（p-P65（Ser536）、P65、IκBα）及TLR4、TRIF、Myd88蛋白表达。结果:（一）胃炎、肠化、胃癌患者P.anaerobius丰度变化我们收集了胃炎、肠化、胃癌患者胃黏膜样本行16S r RNA测序,通过LEFSe分析筛选了胃炎、胃癌患者胃黏膜显著差异的细菌。结果表明在属水平上胃癌患者消化链球菌属（Peptostreptococcus）丰度显著高于胃炎患者。进一步分析发现消化链球菌属相对丰度在胃炎、肠化、胃癌三个阶段呈递增趋势,差异有统计学意义（P＜0.05）。为了证实测序结果,我们收集了胃炎、肠化、胃癌患者胃黏膜组织蜡块,对蜡块切片行FISH实验检测P.anaerobius菌定植,FISH实验结果与测序结果相一致,P.anaerobius菌在胃炎、肠化、胃癌患者胃黏膜丰度逐渐增高。以上结果表明胃炎、肠化、胃癌三个病变阶段P.anaerobius菌丰度逐渐增高,提示其可能参与胃黏膜癌变过程。（二）P.anaerobius对胃上皮细胞生物学行为的影响结果一提示P.anaerobius可能是胃内致病菌,于是我们进一步构建了P.anaerobius感染胃上皮细胞AGS的体外模型,以明确P.anaerobius对胃上皮细胞的生物学行为影响。电镜实验结果表明P.anaerobius菌可直接与细胞表面接触,且部分P.anaerobius菌可进入细胞内。CCK-8、EDU实验表明P.anaerobius感染可显著促进胃上皮细胞增殖（P＜0.05）,Transwell侵袭、迁移实验表明P.anaerobius菌可显著促进细胞侵袭、迁移能力（P＜0.001）。此外,P.anaerobius感染显著上调细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、IL-18表达（P＜0.001）,促进细胞炎症。（三）P.anaerobius通过TLR4/TRIF/NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症我们进一步构建了P.anaerobius感染胃上皮细胞AGS、GES-1模型,提取细胞m RNA行转录组测序。分析显示P.anaerobius菌感染细胞后,NF-κB信号通路显著富集,我们推测P.anaerobius菌通过NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症。实验发现P.anaerobius菌可显著上调细胞p-P65（Ser536）、p-IKK（Ser176/180）表达（P＜0.05）,显著下调IκBα表达（P＜0.05）,促进P65入核,且P.anaerobius上调p-P65（Ser536）表达呈MOI依赖。TLRs、TRIF、Myd88是NF-κB信号通路上游,我们发现P.anaerobius菌感染显著上调细胞TLR4、TLR5、TRIF m RNA表达（P＜0.05）,而TLR1、Myd88表达无明显变化。P.anaerobius菌感染后同样上调细胞LTR4、TRIF蛋白表达（P＜0.05）,而Myd88表达无明显变化。于是我们推测P.anaerobius菌可通过TLR4/TRIF激活下游NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症。实验结果表明使用TLR4 si RNA抑制TLR4表达后可抑制P.anaerobius介导的NF-κB信号通路激活。使用TLR4 si RNA、抑制剂TAK-242,TRIF si RNA抑制TLR4、TRIF表达后均可明显减轻P.anaerobius介导的细胞炎症因子TNF-α、IL-1β表达（P＜0.01）。（四）P.anaerobius感染对INS-GAS小鼠胃黏膜病变的影响为了明确P.anaerobius感染能否在体内诱导INS-GAS转基因小鼠胃黏膜病变,我们构建了P.anaerobius感染INS-GAS小鼠模型。并首先检测了P.anaerobius定植,结果表明对照组小鼠粪便DNA扩增产物电泳后未见条带,6只感染组小鼠中有4只可见明显的P.anaerobius特异性条带。胃黏膜FISH实验发现感染组小鼠胃内可见P.anaerobius菌定植,以上结果表明P.anaerobius在INS-GAS小鼠胃内成功定植。小鼠胃黏膜H＆E染色显示P.anaerobius感染小鼠胃黏膜明显增厚,可见腺体囊状扩张,黏膜基底部有明显炎症细胞浸润,炎症评分显著高于对照组（P＜0.05）,P.anaerobius感染小鼠胃黏膜CD45免疫组化染色评分显著高于对照组（P＜0.05）。此外P.anaerobius感染可显著上调小鼠胃黏膜炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-18表达（P＜0.05）。小鼠胃黏膜阿尔新蓝-核固红染色可见P.anaerobius感染小鼠胃黏膜有大量呈蓝色的泌酸性黏液腺体,表明P.anaerobius感染与黏膜肠化有关。我们进一步验证了P.anaerobius感染对小鼠胃黏膜NF-κB信号通路关键蛋白及TLR4、TRIF、Myd88蛋白表达的影响,结果表明P.anaerobius菌感染可显著上调小鼠胃黏膜TLR4、TRIF、p-P65（Ser536）表达,促进P65入核,下调IκBα表达（P＜0.05）。结论:1.P.anaerobius感染可介导胃上皮细胞生物学行为改变,引起INS-GAS小鼠胃黏膜病变,促进体内外炎症反应;2.P.anaerobius感染通过TLR4/TRIF/NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症,抑制TLR4及TRIF可明显减轻P.anaerobius感染介导的炎症反应。