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类病变突变体在没有病原菌侵染的情况下,就能自发形成类似超敏反应的坏死斑,并且大部分还具有病原菌抗性。因此,类病变突变体是研究植物程序性细胞死亡、超敏反应和防卫反应的好材料。 本实验室在前期工作中通过γ射线诱变日本晴(Oryza sativa ssp.japonica)种子,获得了一个性状稳定的类病变突变体lmm5(lesion mimic mutant5),其叶片和叶鞘上散布着褐色的坏死斑,并且伴随着大量的H2O2累积。该突变体坏死斑的发生受光照诱导,发生程度受光照总量影响。 遗传分析表明,lmm5的类病变表型在粳稻背景下由单隐性核基因控制,而在籼稻背景下却由双隐性核基因控制。利用lmm5和籼稻品种明恢63杂交构建的定位群体,通过图位克隆的方法,分别在第一和第四染色体上获得lmm5的两个野生型基因LMM5.1(Os01g0116600)和LMM5.4(Os04g0595300)。在lmm5中,LMM5.1发生缺失突变,但是LMM5.4的核苷酸序列与日本晴完全一致。随后的研究发现,LMM5.1在籼、粳稻中均表达,LMM.4的表达量在籼稻中较高,但是在粳稻中却很低,这就解释了lmm5与籼稻和粳稻杂交F2代植株表型分离比不一致的现象。 LMM5.1和LMM5.4高度同源,两者均编码eEF1A-like蛋白(eukaryotic translationelongation factor1A like protein)。目前已报道的eEF1A-like蛋白只有三种,其功能均不涉及细胞死亡和防卫反应,并且与LMM5的序列同源性只有30%,因此,LMM5是一个新的eEF1A-like蛋白家族成员。亚细胞定位显示,LMM5蛋白作用于细胞质。 运用Real-time PCR和转录组测序的方法,发现lmm5体内的病原菌防卫信号被组成型激活,并且该突变体对白叶枯病和稻瘟病呈现广谱抗性。另外,在水稻防御反应初期,LMM5的转录水平下调。因此,我们认为LMM5是水稻基础免疫的负调控因子。 较之野生型,lmm5叶片内的脱落酸(abscisic acid,ABA)含量显著升高,对lmm5施用外源ABA能加速坏死斑的发生,而降低内源ABA含量可以抑制坏死斑的发生并降低病原菌抗性。野生型叶片内LMM5的表达水平却不受内源和外源ABA影响。以上结果说明LMM5影响内源ABA的积累,但是不受ABA的反馈调节,ABA正调控由LMM5突变引起的细胞死亡和防卫反应。此外,外源茉莉酸(jasmonic acid,JA)能够抑制lmm5坏死斑的发生,其抑制作用可以被ABA解除,而ABA对lmm5细胞死亡的促进作用也可被JA抑制,暗示JA与ABA以相反的方式,调控lmm5坏死斑的发生。 此外,本研究通过酵母双杂交系统筛选到两个与LMM5.1互作的蛋白:类硫氰酸酶蛋白(rhodanese-like domain containing protein,RLDP)和膜连蛋白A7(annexinA7,AA7);并且在实验过程中获得了一个lmm5表型回复突变体,并对其进行了遗传分析。这为下步深入研究LMM5的功能提供了便利。