研究目的高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,hHcys)是终末期肾病进展过程中的一个关键独立致病因子,这一点已非常明确,但hHcys致肾脏损伤的病理生理学机制仍须深一步研究。近年来,表观遗传学在肾脏疾病中的研究受到越来越多的关注,组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)对于组蛋白赖氨酸残基的乙酰化水平的调控是其重要内容之一。HDAC共分为四类18个亚型:Ⅰ类(ClassⅠ)为Rpd3 样蛋白,包括HDAC1,HDAC2,HDAC3,HDAC8;Ⅱ类(ClassⅡ)为Hdal 样蛋白,又分Ⅱa类即HDAC4,HDAC5,HDAC7,HDAC9 和Ⅱb类即HDAC6,HDAC10;Ⅲ类(ClassⅢ)为Ser2 样蛋白,包括SIRT1-7;Ⅳ类(ClassⅣ)为HDAC11。ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ为Zn2+依赖型,Class Ⅲ为NAD+依赖型。越来越多的证据也表明HDAC可调控非组蛋白的去乙酰化。虽然,广谱类HDAC抑制剂在肿瘤治疗领域已经展现出良好的应用前景,但其缺点也非常明显,如缺乏对HDAC亚型的特异性作用,进而引起的副作用也比较严重。并且,有研究发现HDAC参与到了肾脏纤维化进程中,虽然其所介导的肾脏纤维化机制并不十分清楚,可能与调节炎性因子、促纤维化因子的表达和激活介导肾脏纤维化信号通路有关。因此,在hHcys致肾脏损伤中,何种亚型HDAC起到作用及其机制有待明确和探讨。研究表明,Hippo信号通路与肾脏损伤有着密切的联系,参与肾脏纤维化等过程。为此,本课题将研究HDAC在hHcys诱导的肾脏损伤中的作用,并进一步阐明Hippo信号通路是否参与相关调控。实验方法与结果1.HDAC在hHCys模型动物肾脏中的表达对C57BL/6J野生雄性小鼠(10周龄)摘除单肾,一周后随机分为两组,采用不含叶酸的饲料喂养8周来构建hHcys动物模型,喂养正常饲料组作为对照。高效液相色谱法检测不含叶酸饮食血浆总同型半胱氨酸含量升高,证明hHcys模型构建成功。送检尿液样品中尿白蛋白/肌酐比值升高。过碘酸-雪夫染色方法对小鼠肾脏石蜡切片进行染色和透射电镜的方法观察足细胞损伤,结果显示hHcys小鼠肾脏中出现明显的系膜基质增生,基底膜增厚,足突融合,表明肾小球存在损伤;Masson染色方法对小鼠肾脏石蜡切片进行染色,hHcys模型肾脏中出现纤维化病变,提示肾脏功能障碍,肾小管出现损伤。通过实时荧光定量PCR发现,11个HDAC亚型中HDAC9表达升高最为明显。通过蛋白免疫印迹免疫组织化学染色、免疫荧光双重标记检测HDAC9在肾脏中表达变化和分布,相比其他部分Zn2+依赖型HDAC,HDAC9在hHcys模型小鼠肾脏皮质中表达上调最为明显,在足细胞、远曲小管和集合管中均表达升高。通过L型同型半胱氨酸刺激足细胞和肾小管上皮细胞,结果显示HDCA9呈现剂量依赖性升高。2.HDAC9在hHcys致肾脏损伤中的作用及机制HDAC9基因沉默大鼠模型构建采用大鼠肾脏局部注射重组的包备有shRNA-HDAC9的慢病毒载体pGLV3/H 1/GFPtPuro(pGLV3)介导大鼠肾脏HDAC9基因沉默,二十只SD雄性大鼠随机平均分为四组,构建hHcys动物模型。IF实验结果显示,慢病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)广泛表达,并且与足细胞标志物synaptopodin和集合管标志物AQP3共定位。进行Masson染色分析,结果显示,HDCA9沉默减轻高同型半胱氨酸血症诱导的肾脏纤维化。PAS染色结果说明,肾小球基底膜的增厚和系膜增生能一定程度上被HDAC9沉默所缓解。体内实验IF、IHC和体外实验WB结果显示由hHcys所介导的足细胞裂孔隔膜相关蛋白nephrin表达下调和正常结构形态的破坏能够一定程度上被HDAC9的沉默所逆转,并且纤维连接蛋白fibronectin这一促纤维化因子在hHcys介导下的高表达能够一定程度上被HDAC9的沉默所抑制。hHcys模型大鼠肾脏中,Hippo核心蛋白YAP表达上调,可被HDAC9沉默所抑制。体外实验中,L-Hcys能够诱导HK-2细胞中YAP的表达上调,基因沉默HDA9可以阻断YAP对Hcys的应答,并且下游Smad2、Smad3的活性也被抑制,表明HDAC9可能通过YAP-Smad2/3信号通路来促进hHcys诱导的肾脏损伤。结论与创新性1.本研究次发现HDAC9在hHcys模型小鼠和大鼠肾脏中显著升高,并且在HK-2和HPC细胞中,HDAC9呈现出Hcys剂量依赖性升高。基因沉默HDAC9减轻了 hHcys介导的肾小球损伤、裂孔隔膜相关蛋白的表达下调和结构破、促纤维化因子的高表达从而减轻足细胞损伤和肾脏纤维化,表明HDAC9在hHcys致肾脏损伤中起到重要的作用。2.本研究首次发现HDAC9促进肾脏损伤的作用可能与其参与调控Hippo信号通路有关。该研究对于高同型半胱氨酸血症致肾脏损伤的病理生理学机制有了更深入的认识,并为HDAC9作为靶点治疗肾脏纤维化相关疾病提供一定的理论依据和实践基础。