大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引发的黄萎病,是造成包括棉花、茄子、马铃薯等在内的多种农作物减产的重要危害,在世界范围内造成严重的农业经济损失。在我国,棉花黄萎病已经成为棉花高产的主要障碍。已有研究表明,大丽轮枝菌的分泌蛋白在侵染寄主过程中发挥重要作用。因此,致病相关分泌蛋白的筛选和功能鉴定已经成为大丽轮枝菌致病机理研究的热点问题。在对病原菌与寄主互作的长期研究过程中,研究人员发现大丽轮枝菌分泌蛋白中的小分子量富含半胱氨酸蛋白(Small,cysteine-rich protein,SCPs)往往参与寄主的侵染和识别,在调节寄主免疫反应中起着关键作用。SCPs一般为小于400个氨基酸且包含超过4个半胱氨酸残基,半胱氨酸之间形成的二硫键可以起到稳定效应蛋白三维结构的作用,以应对寄主植物非原生质体中的恶劣环境。这些小分子量富含半胱氨酸蛋白在寄主缺乏抗病基因时,作为毒力因子参与病原菌的侵染过程;但在寄主含有抗病基因时,则会被抗病基因识别,激活寄主免疫反应。本实验室前期通过生物信息学分析发现,大丽轮枝菌Vd991菌株全基因组编码123个SCPs,但它们在寄主与病原菌之间的相互作用尚未被系统研究。本研究将上述123个VdSCPs在烟草中进行了大规模的瞬时表达,通过诱导细胞坏死反应鉴定参与“寄主-病原菌”互作的候选蛋白。结果发现,其中VdSCP27、VdSCP113和VdSCP126表现出诱导烟草叶片细胞坏死。为了验证3个VdSCPs诱导的细胞坏死为植物引发的抗病反应,本研究进行了免疫反应检测,包括活性氧爆发、胼胝质沉积、抗性基因和病程相关基因的表达分析,结果表明上述细胞坏死为寄主诱导的免疫反应。定点突变结果表明形成二硫键的半胱氨酸对VdSCP126的功能是必需的,但不是VdSCP27和VdSCP113所必需的。为了检测VdSCP27、VdSCP113和VdSCP126的毒力功能,通过对3个VdSCPs表达水平的研究发现,在侵染烟草和棉花植物过程中这3个基因的表达水平均显著上调,提示这3个VdSCPs可能在侵染过程中发挥作用。将3个VdSCPs分别与绿色荧光蛋白(GFP)融合,激光共聚焦显微镜下观察发现绿色荧光均沿细胞外周区域聚集,说明3个诱导坏死的VdSCPs均定位于细胞膜外,为质外体激发子蛋白。采用同源双交换法构建大丽轮枝菌基因敲除突变体菌株鉴定致病性,发现突变体菌株与野生型菌株相比致病性均无显著性差异,表明VdSCP27、VdSCP113和VdSCP126对大丽轮枝菌在烟草和棉花的侵染过程中不是所必需的。为研究大丽轮枝菌如何逃逸3个VdSCPs所诱导的植物免疫反应机制,将已知抑制免疫反应的效应蛋白VdCBM1与上述诱导坏死的3个VdSCPs共注射烟草叶片,验证细胞坏死反应并进行免疫反应检测。结果表明,VdCBM1有效抑制VdSCPs所诱导的细胞坏死及相关免疫反应。提示大丽轮枝菌利用VdCBM1蛋白抑制VdSCP27、VdSCP113和VdSCP126引发的植物抗性反应,以促进其在寄主中的侵染。