【摘 要】
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目的:脊髓损伤是最严重的创伤性疾病之一,不仅导致运动,感觉和自主神经功能障碍,造成永久性残疾,还会留下肌肉萎缩、慢性疼痛和尿路感染等继发问题。这些功能障碍由最初的原发性损伤以及随后发生的持续数周甚至数月的继发性损伤引起。血脊髓髓屏障特殊的细胞结构及细胞间高度发达的紧密连接蛋白和粘附连接蛋白可以阻止外周循环中的物质进入脊髓,为脊髓组织提供特殊的微环境。血脊髓屏障在脊髓损伤后早期被破坏,血细胞进入脊髓
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目的:脊髓损伤是最严重的创伤性疾病之一,不仅导致运动,感觉和自主神经功能障碍,造成永久性残疾,还会留下肌肉萎缩、慢性疼痛和尿路感染等继发问题。这些功能障碍由最初的原发性损伤以及随后发生的持续数周甚至数月的继发性损伤引起。血脊髓髓屏障特殊的细胞结构及细胞间高度发达的紧密连接蛋白和粘附连接蛋白可以阻止外周循环中的物质进入脊髓,为脊髓组织提供特殊的微环境。血脊髓屏障在脊髓损伤后早期被破坏,血细胞进入脊髓实质,并产生促炎因子和趋化因子等炎性介质,造成更严重的损伤。骨髓间充质干细胞在脊髓损伤中已显示出良好的治疗效果,但同时又具有诸多局限性。外泌体作为干细胞内部起源的纳米级细胞囊泡,携带亲代细胞分泌的具有生物学活性的功能性物质,如DNA、mRNA、miRNA和蛋白质。而外泌体促进脊髓损伤的修复机制还不明确,本研究主要探究外泌体对脊髓损伤后血脊髓屏障完整性的影响及其可能的机制。方法:培养骨髓间充质干细胞,并使用试剂盒从培养上清中提取外泌体。60只SD大鼠随机分成3组（n=20）:假手术组（仅切除椎板）、模型组（损伤后注射PBS）和外泌体治疗组（损伤后注射外泌体）,采用改良Allen’s法构建大鼠脊髓损伤模型。在损伤后的第3天,经尾静脉注射伊文思蓝染料,观察染料的渗出量来反映血脊髓屏障的通透性;采用蛋白免疫印迹法检测与血脊髓屏障相关的紧密连接蛋白的表达情况。分别使用免疫印迹法和明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-9的蛋白表达量和活性。通过脊髓组织石蜡切片免疫荧光观察建模后中性粒细胞的浸润情况,使用HE染色观察损伤后脊髓组织的形态学变化。通过BBB评分量表评估3周内大鼠运动功能的恢复情况。结果:1.体外成功培养骨髓间充质干细胞,并从生长良好的P3-P6代细胞培养基中提取外泌体,通过透射电镜观察外泌体为直径约100nm的脂质双层圆形囊泡,免疫印迹结果表明,提取的外泌体中标志蛋白Alix、CD63阳性表达。2.外泌体治疗后血脊髓屏障的通透性降低,我们检测了与血脊髓屏障完整性密切相关的紧密连接蛋白的表达量,免疫印迹结果发现,脊髓损伤后,紧密连接蛋白表达量显著下降,而外泌体显著减少紧密连接蛋白降解。3.MMP-9能够降解紧密连接蛋白,为确定外泌体的治疗作用是否是通过MMP-9介导的,我们测定了MMP-9的表达和活性,结果表明,外泌体治疗显著抑制了MMP-9的表达和活性。4.血脊髓屏障破坏后会导致中性粒细胞的浸润,进一步加重损伤,免疫荧光结果表明,外泌体治疗后中性粒细胞的浸润显著减少。5.HE染色结果表明,外泌体治疗显著减少脊髓损伤区域面积、减少神经元的丢失。外泌体治疗组大鼠的BBB评分显著高于模型组。结论:BMSCs衍生的外泌体通过下调MMP-9的表达和活性来减少紧密连接蛋白的降解,从而减轻血脊髓屏障的破坏和随后的中性粒细胞的浸润,进而促进脊髓损伤后运动功能的恢复
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