本研究皮下接种法建立小鼠肝癌移植瘤动物模型，通过构建由KDR启动子调控的、微泡造影剂协同超声辐照介导的、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSK-tk)基因系统，探讨了自杀基因靶向肝癌血管治疗肝癌的可行性和有效性，为建立一种新型、安全、高效的基因转染模式奠定初步的实验基础。 第一部分小鼠皮下肝癌移植瘤模型的建立与鉴定建立与鉴定C57BL/6J小鼠皮下肝癌移植瘤模型。 常规体外培养小鼠Hepa1-6肝癌细胞，每只小鼠右侧腰胁部皮下接种0.1mLHepa1-6细胞悬液(2×10<6>/mL)，定期测量肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线。超声检测肿瘤的二维及彩色超声所见，筛选基因治疗理想的动物模型。剥取肿瘤行常规及病理学检查。 小鼠肝癌皮下移植瘤成功率为85﹪(17/20)；超声所见瘤体回声类型可表现低、等、混合回声；瘤体最大径线小于1.5cm者内无液化表现，大于1.5cm者瘤体内有不规则液区。病理证实为肝细胞性肝癌。 通过皮下接种法建立的小鼠肝癌具有操作简便、模型稳定，成功率高等特点，超声监测可做为此模型监测和筛选的重要手段。 第二部分微泡造影剂联合超声辐照对小鼠肝癌微血管通透性的影响。 目的：观测微泡造影剂联合超声辐照对肝癌微血管通透性的影响。 方法：建立小鼠(C57BL/6J)肝癌皮下移植瘤模型30只，随机分为3组,各组分别经尾静脉注入FD500(0.5mL)、FD500(0.5mL)、FD500(0.5mL)+SonoVue(0.1mL)，后2组分别予以脉冲性超声辐照(1MHz，3w/cm<2>，10min)。荧光显微镜下计测大分子荧光素物质FD500穿透血管内皮细胞膜或微血管壁显影情况。HE染色行肿瘤病理学检查。结果超声辐照组和SonoVue联合超声辐照组阳性显影的微血管计数分别为12.82±1.19和20.65±1.23，p<0.05，对照组无阳性计数。HE染色各组标本均未见明显的坏死及炎性浸润。 结论：超声辐照可提高微血管壁通透性，SonoVue可增强该效应。 第三部分微泡造影剂联合超声辐照介导绿色荧光蛋白质粒转染小鼠肝癌的实验研究。 目的：研究不同物理参数对基因转染效率的影响，确定最佳的剂量-效应关系。 方法：按第一部分方法建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型。将微泡造影剂SonoVue和pEGFP混合，4℃静上30min，按不同的转染条件依次分组。 1.荷瘤鼠16只，尾静脉注入60μl SonoVue和60μg pEGFP。辐照频率1MHz，辐照声强3w/cm<2>。根据不同辐照时间随机分为4组：对照组(无辐照)、1min、5min、10min。 2.荷瘤鼠16只，尾静脉注入60μl Son0Vue和60μg pEGFP。辐照频率1MHz，辐照时间5min。根据不同的辐照声强随机分为4组：对照组(无辐照)、1w/cm<2>、2w/cm<2>、3w/cm<2>。 3.荷瘤鼠16只，尾静脉注入超声造影剂和60μg pEGFP。辐照频率1MHz，辐照时间5min，辐照声强2w/cm<2>。根据超声SonoVue不同剂量分为4组：对照组(无造影剂)、30μl组、60μl组、90μl组。 4.荷瘤鼠16只，分为4组：A组，pEGFP(60μg)组；B组，pEGFP(60μg)+SonoVue(60μl)组；C组，pEGFP(60μg)+超声辐照组；D组pEGFP(60μg)+SonoVue(60μl)+超声辐照组。 实验结束7天后处死小鼠，流式细胞仪和荧光显微镜检测鼠肿瘤组织中pEGFP表达。 结果： 1.对照组肿瘤组织内无EGFP的表达，辐照时间5min(23.22﹪±1.91﹪)、10min(24.41﹪±1.51﹪)EGFP转染率与1min(16.04﹪±1.61﹪)组比较差异有显著性(P<0.05)，与对照组(2.73﹪±0.42﹪)比较差异有显著性(P<0.01)，但5min组与10min组EGFP转染率无显著性差异(P>0.05)。 2.对照组肿瘤组织内无EGFP的表达，流式细胞仪检测2W/cm<2>组(21.02﹪±1.45﹪)和3w/cm<2>组(23.22﹪±1.91﹪)与1w/cm<2>组(16.33﹪±1.59﹪)相比，EGFP转染率有显著性差异(p<0.05)，与对照组(2.73﹪±0.42﹪)比较差异有显著性(p<0.01)，而2w/cm<2>组和3w/cm<2>组之间EGFP的转染率差异无显著性(p>0.05)。 3.30μSonoVue组(15.57﹪±1.45﹪)与对照组(13.01﹪±1.21﹪)(仅超声辐照无SonoVue)比较，肿瘤组织内EGFP转染率无显著性差异(p>0.05)。60μ组(21.02﹪±1.45﹪)、90μ组(22.97﹪±1.87﹪)与30μ组、对照组比较EGFP的转染率均有显著差异(p<0.05)，而60μ组和90μ组间EGFP的表达没有显著性差异。 4.流式细胞仪检测结果显示D组肿瘤组织内EGFP转染率(20.87﹪±2.21﹪)与C组(12.77﹪±1.69﹪)比较差异有显著性(p<0.05)；D组、C组与A组EGFP转染率(2.14﹪±0.51﹪)比较差异有显著性(p<0.01)。A组与B组(2.73﹪±0.42﹪)EGFP转染率比较差异无显著性(p<0.05)。 结论：不同的辐照条件和造影剂量对基因转染率有明显影响。结果表明1MHz、2W/cm<2>、5min、60μSonoVue是本研究最适宜的物理参数。SonoVue本身不介导基因转染，但可明显增强超声辐照介导的基因转染。 第四部分：微泡造影剂联合超声介导HSV-TK基因系统靶向血管治疗小鼠肝癌。 目的：评估微泡造影剂SonoVue联合超声辐照介导KDR启动子-单纯疱疹病毒胸苷激酶基(HSV-tk)系统(pKDR-tk)结合更昔洛韦(GCV)靶向血管治疗小鼠肝癌的有效性. 方法：小鼠(C57BL/6J)肝癌皮下移植瘤模型40只，随机分为4组，每组10只。分别经尾静脉注入磷酸缓冲盐溶液(PBS)、pKDR-tk(60gg)、pKDR-tk(60μg)+Sonovue(60μl)、pKDR-tk(60μg)+SonoVue(60μl)，后两组分别给予1MHz，2W/cm<2>，5min的超声辐照，第二天重复治疗一次。24小时后各组小鼠腹腔内注射GCV100mg/kg/d，连续10天，监测肿瘤体积，计算抑瘤率，观测小鼠生存时间。RT-PCR分析肿瘤组织内TK mRNA的表达。抗CD34免疫组化检测肿瘤组织微血管密度(MVD)。TUNEL染色检测肿瘤组织内的细胞凋亡。 结果： 1.抑瘤率在PBS组(A组)、pKDR-tk/GCV组(B组)、pKDR-tk+US/GCV组(C组)、pKDR-tk+US+SonoVue/GCV组(D组)分别为0﹪、3.6﹪±2.7﹪、21.4﹪±2.9﹪和40.7﹪±4.5﹪统计学分析，D组与BN，D组与C组，C组与B组之间均有统计学差异(p<0.05)。 2.各组小鼠平均生存时间分别为54.5±6.4d、56.2±5.1d、82±7.9d、98d±7.7d。D组与B组(p<0.01)，C组与B组(p<0.05)间生存时间有统计学差异。B组与A组(P>0.05)间生存时间无统计学差异。D组生存时间虽长于C组，但差异无统计学意义(p>0.05)。 3.半定量RT-PCR分析肿瘤组织内TK mRNA的表达：C组、D组肿瘤组织内均有TKmRNA的表达；B组极低水平表达TK mRNA：A组无TK mRNA表达。 4.各组肿瘤微血管密度分别为：A组，48.8±5.1；B组，44.2±6.4；cN，27.4±3.2：D组，12.3±1.4。统计学分析，B组与A组，p>0.05：C组与A组，p<0.05；D组与A组，p<0.01；DN与C组，p<0.05。 5.TUNEL染色检测肿瘤组织内的细胞凋亡：与A组、B组比较，镜下C组、D组中可见着色的凋亡细胞显著增多，D组更为明显。凋亡指数分别是：A组，14﹪±1.2﹪；B组，17﹪±1.8﹪；C组，25﹪±3.6﹪：D组，36﹪±3.8﹪(D组与C组，p<0.05；D组与A组，p<0.01； C组与A组，p<0.01：B组与C组，p>0.05)。 结论：微泡造影剂联合超声辐照介导的pKDR-tk基因可有效靶向破坏小鼠肝癌微血管；诱导肿瘤组织的细胞凋亡；延缓肿瘤生长，延长小鼠生存时间。