近些年来,脑血管疾病在世界范围内已经成为最主要的死亡原因之一,这其中,脑缺血性疾病所占比例超过80%。早期恢复脑血流再灌注是救治脑缺血患者最有效的手段。但是再灌注治疗有其两面性：一方面血管再通,可使缺血脑组织功能得以恢复,病情得到控制,但另一方面部分患者脑功能不仅没能恢复,反而出现病情进一步加重,此即缺血再灌注损伤。实验证明,多种病理过程都可引起缺血再灌注损伤发生。研究再灌注损伤的机制,为治疗脑缺血疾病治疗及再灌注损伤的预防提供了重要理论基础。固有免疫系统被视为机体的第一道防线。入侵机体的病原体表面含有病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP),它们可以被含有模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR)的固有免疫细胞识别,进而启动免疫应答。NLRP3是胞浆内模式识别受体NOD样受体家族一员,当细胞受到感染等刺激时,被激活NLRP3能够通过结合蛋白ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing)招募pro-caspase-1,并形成NLRP3炎性体。在炎性体的作用下,pro-caspase-1被激活成为caspase-1,而后者进一步将IL-18和IL-1p的前体裂解成为有重要生物活性的炎症因子,可以参与多种炎症反应过程。近年来的研究表明,阿尔茨海默病、2型糖尿病、动脉粥样硬化、炎性肠病等的发病与进展都与NLRP3有密切关联,但是NLRP3在脑血管疾病中的作用尚不明确。本实验拟通过构建脑中动脉栓塞模型和细胞的OGD模型从体内和体外两方面来研究NLRP3在缺血再灌注损伤中的作用及可能的机制。目的：1、研究小鼠缺血再灌注损伤后NLRP3及其下游分子在脑内的表达及其作用；2、研究小胶质细胞和血管内皮细胞在NLRP3介导下加重缺血再灌注损伤的机制；3、研究缺血再灌注损伤中NADPH氧化酶对NLRP3通路的调控作用。方法：第一部分：小鼠缺血再灌注损伤后NLRP3及其下游分子在脑内的表达及作用1、野生型小鼠缺血再灌注模型建立及模型评价1.1实验小鼠随机分组,建立脑中动脉栓塞模型。1.2通过神经学评分、TTC染色评价模型是否建立成功。2、脑缺血再灌注损伤后NLRP3在小鼠脑中表达的变化及分布通过实时定量PCR、Western Blot、组织免疫荧光染色检测NLRP3在损伤后的表达变化及脑内分布。3、通过RT-PCR来检测脑内四种主要细胞NLRP3mRNA的表达情况4、NLRP3基因敲除鼠经缺血再灌注处理后脑损伤改变及机制4.1NLRP3基因敲除鼠基因型鉴定、分组及模型制备4.2通过小鼠脑MRI平扫反映小鼠脑损伤整体程度；通过HE染色、Nissl染色、TUNEL染色分析组织损伤和神经元凋亡程度。4.3血管神经单元形态和功能检查4.4Western Blot和ELISA分别检测各组脑组织中Caspase-1和细胞因子的表达变化4.5Western Blot和明胶酶谱法分别检测各组脑组织中MMP9的蛋白含量和活性第二部分：小胶质细胞在NLRP3介导下加重缺血再灌注损伤的机制1、糖氧剥夺(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)模型建立本实验选用小鼠来源的小胶质细胞株BV2细胞作为研究对象。将细胞随机分组。Western Blot检测OGD处理后BV2细胞中NLRP3、Caspase-1、NOX2表达以及NADPH氧化酶活性变化。2、对分别转染shRNA-NLRP3和shRNA-NOX2的BV2细胞进行OGD处理,随后检测NLRP3下游分子的变化2.1BV2细胞转染2.2对转染shRNA-NLRP3的BV2细胞进行OGD处理,随后检测细胞NLRP3下游分子的变化。2.3对转染shRNA-NOX2的BV2细胞进行OGD处理,随后检测细胞NLRP3的蛋白变化。2.4BV2细胞被分别转染shRNA-NLRP3和shRNA-NOX2并接受OGD处理,随后通过ELISA检测其细胞因子的变化。3、神经元与BV2细胞共培养实验BV2细胞在共培养上层皿孵育过夜。对分别转染空质粒和shRNA-NLRP3的BV2细胞进行OGD处理。然后使之与下层皿中的神经元共同培养。通过TUNEL染色计数神经元细胞凋亡率。第三部分：内皮细胞在NLRP3介导下加重缺血再灌注损伤的机制1、内皮细胞OGD模型建立本实验选用小鼠来源的脑微血管内皮细胞株bEND.3细胞作为研究对象。将细胞随机分组。Western Blot检测OGD处理后bEND.3细胞中NLRP3、Caspase-1、 MMP2/9、ZO-1、TJP-2表达及Caspase-1活性变化。2、对转染shRNA-NLRP3的bEND.3细胞进行OGD处理,随后检测相关分子的变化2.1脂质体介导的bEND.3细胞转染2.2bEND.3细胞转染shRNA-NLRP3并接受OGD处理后,通过Western Blot检测其MMP2/9、ZO-1、TJP-2的蛋白表达变化。2.3ELISA检测OGD处理后上述各组细胞培养基中细胞因子的表达变化。3、体外内皮细胞通透性实验内皮细胞接种到胶原包被的小室内,孵育细胞48小时直至形成单层细胞。OGD处理后,通过测量穿过胶原层的dextran含量来反映脑内皮细胞通透能力。4、IL-1β对内皮细胞通透性的影响为验证IL-1p对内皮细胞通透性的影响,我们使用含有不同浓度IL-1p的培养基培养内皮细胞,并检测内皮细胞通透性改变及相关分子表达。第四部分：缺血再灌注损伤中NADPH氧化酶对NLRP3通路的调控作用1、野生型小鼠脑缺血再灌注后NOX2表达及活性变化2、脑缺血再灌注后野生型及NOX2-/-小鼠脑损伤形态学比较通过小鼠脑MRI平扫反映小鼠脑损伤整体程度。水肿面积分析及神经学评分进一步证实。3、Western Blot检测NOX2-/-小鼠损伤后NLRP3表达变化4、数据处理结果：第一部分：小鼠缺血再灌注损伤后NLRP3及其下游分子在脑内的表达及作用1、野生型小鼠缺血再灌注模型建立及模型评价每组平均有15%小鼠因为死亡或是神经学评分小于3分而被剔除。2、脑缺血再灌注损伤后NLRP3在小鼠脑中表达的变化及分布通过实时定量PCR和Western Blot分析,我们发现NLRP3在损伤后表达有显著的升高,并且在24小时达到高峰。通过免疫荧光染色得出,NLRP3主要表达于小胶质细胞和血管内皮细胞。另外损伤后Caspase-1和细胞因子IL-1β、IL-18表达也呈升高趋势。3、通过RT-PCR来检测脑内四种主要细胞NLRP3mRNA的表达情况通过RT-PCR分析,NLRP3的mRNA主要表达于小胶质细胞和血管内皮细胞4、NLRP3基因敲除鼠经缺血再灌注处理后脑损伤改变及机制通过MRI平扫我们发现NLRP3缺失后,再灌注脑损伤的面积明显缩小,同时脑水肿程度也有所减轻。HE染色,Nissl染色和TUNEL染色从组织学和神经元凋亡方面证明在敲除NLRP3后脑损伤减轻。我们采用依文思蓝外渗试验和电镜成像分别检测再灌注损伤后血管神经单元功能和形态的变化,并且我们发现尽管缺血再灌注后血管神经单元的功能和形态都出现明显损伤,但是NLRP3敲除鼠血脑屏障损伤较野生鼠轻,表现为依文思蓝外渗量降低,内皮细胞形态良好,紧密连接较完整,血管周围水肿不明显。通过进一步分子水平检测,我们发现脑损伤后Caspase-1、MMP9、细胞因子的高表达都可以因为NLRP3的敲除有明显降低。第二部分：小胶质细胞在NLRP3介导下加重缺血再灌注损伤的机制1、糖氧剥夺(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)模型建立建立OGD模型,通过Western Blot分析,我们检测到BV2细胞中NLRP3、 Caspase-1、NOX2表达在OGD后有显著升高,Caspase-1、NOX2的活性也有升高趋势。2、对分别转染shRNA-NLRP3和shRNA-NOX2的BV2细胞进行OGD处理,随后检测NLRP3下游分子的变化2.1Western Blot显示,与对照组BV2细胞相比,转入shRNA-NLRP3或shRNA-NOX2的BV2细胞NLRP3或NOX2表达明显降低,有显著性差异。2.2ShRNA-NLRP3的转染所引起的NLRP3表达下降可以削弱OGD所引起的Caspase-1表达及活性升高程度。2.3ShRNA-NOX2的转染所引起的NOX2表达下降可以减弱OGD所引起的NLRP3表达升高程度。2.4ELISA结果显示,OGD处理后,BV2细胞的细胞因子(IL-1β、IL-18、 TNF-α、IL-6)表达明显升高,然而,我们发现不管是抑制细胞的NLRP3还是NOX2的表达,OGD处理后的BV2细胞因子含量都较Scramble处理组和正常细胞处理组有显著地降低。3、神经元与BV2细胞共培养实验通过建立Transwell共培养模型,我们得出在OGD过程中,BV2细胞对神经元有毒性作用。通过转染分别抑制BV2细胞NLRP3或NOX2的表达,再次与神经元共培养,结果显示BV2细胞对神经元的毒性作用有所减弱。第三部分：内皮细胞在NLRP3介导下加重缺血再灌注损伤的机制1、OGD模型建立建立不同时间点的OGD处理模型,通过Western Blot分析,我们检测到bEND.3细胞中NLRP3、Caspase-1、MMP2/9表达在OGD后有显著升高,而ZO-1、TJP-2则出现降低趋势。2、对转染shRNA-NLRP3的bEND.3细胞进行OGD处理,随后检测相关分子的变化通过转染shRNA-NLRP3抑制bEND.3细胞NLRP3的表达,并对细胞进行OGD处理,我们检测到细胞MMP2/9和相关细胞因子的升高程度被抑制,而ZO-1、TJP-2的降低趋势也较对照组有所缓和。3、体外内皮细胞通透性实验通过体外内皮细胞通透性实验我们发现,OGD处理后内皮细胞通透能力显著增高,但是抑制内皮细胞NLRP3表达后,内皮细胞通透性增高水平有所降低。4, IL-1β对内皮细胞通透性的影响经过IL-1β处理后,内皮细胞通透性升高,MMP2/9表达增高,ZO-1、TJP-2含量降低。第四部分：缺血再灌注损伤中NADPH氧化酶对NLRP3通路的调控作用建立缺血再灌注模型,通过MRI平扫,我们发现NOX2缺失后,再灌注脑损伤的面积明显缩小,同时脑水肿程度也有所减轻。通过Western Blot分析得出,缺血再灌注损伤过程中NOX2缺乏可以使NLRP3表达下降,进而影响到整个NLRP3通路。结论：1、体内实验证明,NLRP3的缺乏可以使脑梗死损伤程度减轻,血脑屏障功能得到保护,进而减轻缺血再灌注后的小鼠脑损伤程度。2、我们进一步发现,在缺血再灌注损伤过程中,NLRP3引起的脑损伤与其介导产生的细胞因子通过自分泌和旁分泌模式作用于血管神经单元有关。体外实验中,NLRP3炎性体介导的小胶质细胞的神经毒性以及内皮通透性的升高都证明了这一点。3、在缺血再灌注损伤过程中,NADPH氧化酶不仅可以激活NLRP3炎性体通路,还可以引起NLRP3表达升高,从而加重了NLRP3通路所介导的脑损伤。