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木聚糖酶可以降解麦类饲料中的木聚糖,降低消化道食糜的黏性,破坏植物细胞壁,释放细胞内的养分,促进动物对饲料中营养物质的利用。毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一。为确定木聚糖酶基因在毕赤酵母中表达后所分泌木聚糖酶的特性,本试验从体外和体内两个方面对该木聚糖酶的一些基本性质进行了研究。 首先在实验室采用还原糖法(即DNS法)对该木聚糖酶的一些基本性质(包括最适pH和pH稳定性、最适温度和温度稳定性、酶反应动力学参数、酶的底物特异性及蛋白酶对酶活性的影响)进行研究。在不同pH的缓冲液中测定该酶的活性,结果表明该酶的最适pH为6.1,在37、40、50℃保温30、60min后,酶在pH5—10之间具有较好的稳定性,不同保温时间对酶活影响差异不显著。在不同温度下测定该木聚糖酶的酶活,发现其最适反应温度为51℃,当将酶液在50、60、70、80、90、100℃分别保温30min后,发现其稳定性随温度升高而降低,60℃以下时稳定性较好。配制不同浓度的燕麦木聚糖底物,在51℃、pH6.1下,测得该木聚糖酶的米氏常数Km=6.49mg·mL-1,最大反应速度Vmax=21.05μg·mL-1·min-1。分别以燕麦木聚糖和桦木木聚糖为底物测定酶活,结果以桦木木聚糖为底物时的酶活仅为燕麦木聚糖为底物时的74.21%。37℃下用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理木聚糖酶不同的时间(30、60、120min)后,发现胃蛋白酶处理组酶活损失较大,在60min时只剩1.08%的活性,而胰蛋白酶组在处理120min后仍然可保持80.95%的活性。 在确定了该木聚糖酶基本酶学性质的基础上,又选取10头21kg左右的健康DLY生长猪,按体重随机分成2组,分别饲喂添加了0.1%和1.0%木聚糖酶的饲料。正式试验前先预饲4天,第五天开始,每隔15min饲喂一头猪,于采食2h后将猪屠宰,收集胃、十二指肠和空肠食糜,测定其中木聚糖酶的活性,结果表明:在同一添加水平中,随着食糜的后移,消化道后段食糜中的酶活都显著高于前段,在0.1%组,胃、十二指肠、空肠每克食糜中的酶活分别是1172.84IU、2623.22IU、3627.97IU;而在1.0%组,各段消化道每克食糜中的酶活分别是2270.38IU、2656.81IU、4434.33IU;两个酶水平组差异不显著。 综上所述,在本试验研究条件下,该木聚糖酶的最适反应pH为6.1,在pH5—10之间稳定性较好;最适反应温度为51℃,液体状态时60℃以下稳定性较好。该木聚糖酶在胃中活性受到抑制,而进入到小肠后,酶的活性可以得到一定程度的恢复。