研究背景和目的：乳腺癌已成为近年来发病率最高的女性肿瘤之一,其中三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)约占15%。TNBC指的是ER、PR与HER-2均为阴性的乳腺癌,其特点是预后差,早期和术后转移率高,针对ER、PR的内分泌治疗和针对HER2的Trastuzumab分子靶向治疗等均不适用于TNBC患者,目前治疗方式多为手术并辅以化疗和放疗。因此新的治疗方式对于TNBC患者显得尤为重要。自噬(autophagy)是近年来肿瘤治疗研究的新靶点,在肿瘤的发生和发展过程中起着不可忽略的作用。所谓自噬是细胞存活、分化、发展和形成稳态所必须的一种溶酶体降解现象,该现象被认为是细胞应对多种致病因素的一种适应方式,包括三个主要阶段,分别是自噬启动阶段、自噬体的形成和延伸阶段,以及自噬溶酶体的降解阶段。当细胞出现能量供应不足,或存在物理、化学和生物刺激(如缺氧、药物作用),或细胞内出现衰老细胞器时,细胞可通过溶酶体系统降解自身大分子和细胞器,其降解产物重新参与细胞的能量代谢,这自我消化过程不仅为应激环境下的细胞提供基本的能量保证,还可促使细胞清除自身已损坏的细胞器和入侵的微生物,从而有利于细胞的进一步生长,然而达到一定程度的自噬则会引发细胞的死亡(又称为自噬性死亡-Ⅱ型程序性死亡)。自噬引起的细胞死亡与凋亡是两种独立的生理过程,但也有证据表明二者存在共同同路。Beclin1是由Liang等1998年在致死性sinbis病毒性脑膜炎大鼠中发现的60KD的蛋白质,可与bcl-2基因产物相互作用,抑制Isinbis病毒的复制。研究显示,在多种肿瘤中都出现Beclin-1蛋白表达的下降,与Beclin1诱导自噬息息相关。Beclin1,尤其是定位于内质网的Beclin-1,是诱导自噬的重要因子,其机制主要是与Ⅲ型P13K形成复合物参与募集细胞浆中含FYVE或PX基序的蛋白质,用于自噬体膜的形成,并引导其自噬蛋白定位于自噬体膜。当细胞出现自噬后,如果过多的细胞器或者蛋白质进入自噬小泡而被降解,细胞的功能就会严重受损,出现不可逆的改变,从而导致细胞死亡。细胞过度表达Beclin1可以诱导细胞自噬,而在营养缺乏、缺氧、药物作用等应激条件下更易出现自噬性死亡。在治疗肿瘤的化疗药物中,他莫昔芬、神经酰氨通过上调Beclin1并抑制AKT促进自噬的发生。通过下调Beclin1的表达,则能够显著降低自噬反应,使肿瘤细胞免于死亡,促进肿瘤的发生、发展,例如Beclin-1等位基因敲除的小鼠发生自发性恶性变(包括乳腺癌、肺癌、肝癌等)的概率增加。这些结果提示Beclin-1介导的自噬性死亡可能与肿瘤细胞生长抑制有关。Beclin1调控细胞自噬的同时还影响细胞凋亡：当细胞处于正常状态时,Beclin1可与凋亡调控蛋白Bcl-2家族的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-x1相结合,促进细胞凋亡,而当细胞处于应激环境时,Beclin1与Class Ⅲ PI3激酶结合,形成Beclin1/Class Ⅲ PI3K复合物,再诱导饥饿环境下的细胞自噬,同时还能释放和激活促凋亡蛋白Bax和Bak,从而诱导细胞发生凋亡。Futreal PA等发现,乳腺癌中17q21上等位缺失达到50%,包括三阴性乳腺癌细胞BT-549。本实验旨在研究自噬基因beclin-1对三阴性乳腺癌细胞BT-549生长的抑制作用,为今后以自噬基因为靶点的乳腺癌基因治疗提供科学依据。方法：本实验以人三阴性乳腺癌细胞BT-549用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2培养箱连续贴壁培养,隔天换液,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,取生长状况良好的对数期生长细胞用于实验。将pDsRed-C1和pDS-RED-C1-Beclin1质粒转化大肠杆菌感受态DH5α细胞,所提质粒经测序证实携带Beclin1基因后,进一步扩增用于实验。利用脂质体将真核载体pDS-RED-C1-beclin-1转染进入BT-549细胞,实验共分三组：实验组(转染pDS-RED-C1-Beclin1)、空白组及阴性对照组(转染pDS-RED-C1),并且分别在正常和低氧环境下进行实验,分组后主要检测指标为两类：(1)转染效果(以beclin-1基因mRNA及蛋白表达水平作为标准)；(2)转染效用(以细胞增值率、细胞自噬率、凋亡率及细胞迁移能力为标准)。用RT-PCR检测转染后beclin-1mRNA表达,western blot检测转染后蛋白表达；在正常及低氧环境下分别培养后用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测细胞增殖率：通过转染后24、48、72h的OD值来计算,48h和72h增值率计算分别为(OD48-OD24)/OD24和(OD72-OD24)/OD24；细胞自噬情况由吖啶橙染色后用荧光显微镜观察：转染后24、48、72h随机取5个视野数100个细胞计算自噬比例,细胞发生自噬后细胞质染成橘红或深红,未发生自噬为绿色或黄色；通过流式细胞仪检测转染后细胞凋亡百分比的差异；细胞划痕试验研究转染beclin-1基因对细胞迁移能力的影响：转染后24h利用加样器枪头(10μl)在六孔板培养孔表面划直线,用PBS洗两次去掉因划痕漂浮的细胞,加无血清的RPMI1640,每隔12h在显微镜下观察划痕变化。所有实验结果采用SPSS13.0统计软件计算。RT-PCR和Western blot结果及MTT所测增殖率结果用单因素方差分析-LSD-t检验计算,采用析因设计分析目的基因和低氧刺激的交互作用以及目的基因对增殖率的抑制作用随转染时间产生的变化,白噬和凋亡的差异采用卡方检验分析,检验水准取0.05。结果：1.转染效果的检测：pDS-RED-C1为红色荧光蛋白质粒,在绿色荧光下显红色,可以看到在72h最明显,RT-PCR测定beclin-1mRNA表达结果：空白组、空载体组和目的基因组在137bp处都有明显内参GAPDH条带,在120bp目的基因处,目的基因组条带亮度高于对空白组和空载体组；western blot检测转染后蛋白表达,空白组、空载组体和目的基因组36KD处内参GAPDH一致,在46-60KD目的蛋白(beclin-1一抗为多克隆抗体)处,目的基因组明显深于空白组和空载体组。用Image J1.44软件分析灰度值,在RT-PCR与western blot中,目的基因组与空白组和空载体组差异具有统计学意义(P<0.05),而空白组和空载体组间无明显差别。以上结果证明了beclin-1基因被成功转入BT-549细胞,可以进行下一步实验。2.转染效用的检测：(1).MTT测定细胞增殖率结果：正常与低氧环境下实验组48h和72h增殖率均低于对照组,(48hP1=0.002,P2=0.000；72hP1=0.006,P2=0.001；P1和P2分别为正常与低氧环境下统计结果),从而证明了转染beclin-1基因对BT-549细胞生长的抑制作用,而采取析因设计所得出的结果说明了beclin-1与缺氧环境对细胞生长的抑制作用具有交互性,既二者能增强彼此对细胞增殖的抑制作用。(2).beclin-1转染后细胞的自噬率差异：荧光显微镜下可以明显看出目的基因组染成红色的细胞明显多于其它两组,正常环境下72h空白组、空载体组和目的基因组随机数一百个细胞计算自噬发生率分别为13%、15%、29%,低氧培养下72h三组细胞自噬发生率分别为25%、32%、48%,正常及低氧培养下实验组与空白组和阴性对照组间的白噬率差异具有统计学意义(P<0.0167)(表2),而空白组与阴性对照组间差异无统计学意义(正常和低氧培养统计结果P值分别为0.419和0.174)。该结果说明转染的beclin-1基因确实增强了细胞的自噬水平,从而通过诱导自噬来降低细胞增殖率。(3)细胞凋亡率：自噬和凋亡两种生理学过程已经在很多实验中被证明具有共同通路,而在本实验中也证明了转染beclin-1后正常和低氧环境下细胞的凋亡率均有所升高,且具有统计学差异(P<0.05),可以推断beclin-1对细胞具有诱导凋亡作用,这可能是其降低细胞增殖率的另一种途径。(4).在划痕试验中,可以看到空白组细胞迁移速度快于目的基因组,划痕后36h,空白组划痕已经愈合超过一半,而目的基因组仍有很明显空缺,而在吖啶橙染色中也可以看出发生自噬的细胞较其它细胞更为细长,可以推断beclin-1提高细胞自噬水平的同时降低了其迁移能力。结论：1.转染beclin-1基因后TNBC BT-549在正常和缺氧环境下的增殖率都有明显下降2.beclin-1在增加细胞自噬率的同时诱导产生更多凋亡,二者共同造成对细胞增殖的抑制作用,同时在一定程度上可以使细胞迁移能力降低。