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阻断如PD-1,PD-L1及CTLA-4免疫卡控点的新兴抗肿瘤免疫疗法在多种恶性肿瘤中取得了很大的成功。B7-H4是鲜为人知的免疫卡控点,它在肿瘤细胞、浸润性脊髓细胞和血管中广泛表达。B7-H4对T细胞的抑制作用以及在人类肿瘤中表达的增强预示着它也可以成为肿瘤免疫疗法的有效靶点。然而,到目前为止只知道IL-6和IL-10可诱导B7-H4的表达。本课题研究了在多种肿瘤细胞系如A549、SPC-A-1、MCF-7、B7-H4转基因细胞中,IGF-1和EGF可显著提高B7-H4的蛋白表达水平。由于Akt、ERK为IGF-1和EGF信号通路下游的共同信号分子,由此应用信号通路特异性抑制剂研究哪条信号通路介导了IGF-1和EGF诱导的B7-H4表达。结果表明,Akt信号通路的特异性抑制剂LY294002、Wortmannin在A549和SPC-A-1细胞中并不能改变B7-H4蛋白的表达。而ERK信号通路特异性抑制剂SCH772984在这两种肿瘤细胞中可下调B7-H4蛋白的表达水平。为了进一步验证MAPK/ERK信号通路对B7-H4表达的调控作用,应用mTOR特异性抑制剂rapamycin和p90RSK特异性抑制剂BI-D1870作用细胞。结果表明,rapamycin、BI-D1870在A549和SPC-A-1细胞中均可抑制B7-H4蛋白的表达。综上所述,本课题证明了MAPK/ERK信号通路可调控B7-H4的表达。本论文主要包括以下两部分内容:一、负性共刺激分子B7-H4与PI3K/Akt、MAPK/ERK信号通路相关性的研究【目的】B7-H4的表达是否受到PI3K/Akt、MAPK/ERK信号通路的调控。【方法】IGF-1作用A549、SPC-A-1、MCF-7、H08910、hela、B7-H4转基因细胞24小时后,提取总蛋白,western blot检测B7-H4蛋白表达。实时定量PCR检测IGF-1作用A549和MCF-7肿瘤细胞24小时后B7-H4 mRNA的变化。IGF-1、EGF分别作用MCF-7、A549细胞24小时后,提取总蛋白,western blot检测B7-H4蛋白、PI3K/Akt信号通路相关分子以及MAPK/ERK信号通路相关分子。【结果】在A549、SPC-A-1、MCF-7、H08910、hela、B7-H4转基因细胞中,IGF-1可显著提高B7-H4的蛋白表达水平。IGF-1作用A549和MCF-7肿瘤细胞后B7-H4mRNA无明显变化。IGF-1和EGF两者均上调相关细胞的p-Akt、p-ERK的蛋白水平。【结论】B7-H4的蛋白表达可能受到PI3K/Akt、MAPK/ERK信号通路的调控。二、MAPK/ERK信号通路对肺癌细胞B7-H4蛋白表达的调控【目的】确定在肺癌细胞系中哪条信号通路可调控B7-H4的蛋白表达。【方法】Akt信号通路的特异性抑制剂LY294002、Wortmannin作用A549和SPC-A-1细胞24小时后,提取总蛋白,western blot检测B7-H4蛋白表达水平。ERK信号通路特异性抑制剂SCH772984、mTOR特异性抑制剂rapamycin和p90RSK特异性抑制剂BI-D1870作用A549和SPC-A-1细胞24小时后,提取总蛋白,western blot检测B7-H4蛋白表达水平。EGF和PMA作用SPC-A-1细胞24小时后,western blot检测B7-H4、p-ERK和p-p90RSK的蛋白表达水平。EGF作用SPC-A-1细胞1小时后,加入ERK信号通路抑制剂联合作用SPC-A-1细胞24小时后,western blot检测B7-H4、p-ERK和p-p90RSK的蛋白表达水平。流式细胞术检测EGF作用SPC-A-1细胞24小时后以及EGF和SCH772984联合作用24小时后,SPC-A-1细胞细胞膜B7-H4蛋白的表达水平。【结果】LY294002、Wortmannin作用A549和SPC-A-1细胞后,B7-H4蛋白表达上调;SCH772984、rapamycin、BI-D1870作用SPC-A-1细胞后,B7-H4蛋白表达降低;EGF、PMA作用SPC-A-1细胞后,B7-H4蛋白上调;EGF和ERK信号通路抑制剂联合作用后,B7-H4蛋白表达下调;流式结果显示,EGF作用后SPC-A-1细胞细胞膜B7-H4蛋白上调,联合作用后,胞膜B7-H4蛋白下调。【结论】在肺癌细胞系中,MAPK/ERK信号通路可调控B7-H4的表达。