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第一部分：应用高分辨率熔解曲线分析检测RAS基因突变方法的建立目的：RAS基因突变是急性髓系白血病中最常见的基因突变之一，本研究拟利用LightScanner平台建立高分辨熔解曲线分析检测NRAS和KRAS基因各热变区突变的方法，评价该方法的灵敏度，特异性及可靠性。方法：分别设计扩增NRAS和KRAS基因各热变区的HRM引物和测序引物，应用HRM引物进行PCR扩增，行HRM分析，阳性标本进一步应用测序引物PCR扩增后测序验证，同时应用野生型克隆对突变型克隆进行不同程度稀释后进行检测，评价HRM方法的灵敏度。结果：NRAS和KRAS基因杂合子突变的熔解曲线和熔解峰与野生型明显不同，通过峰型的改变可以很容易识别杂合子突变。NRAS和KRAS基因纯合子突变的熔解曲线峰型与野生型相似，但熔解峰出现可辨识的漂移。HRM分析阳性标本均经DNA测序证实。结论：利用LightScanner平台成功建立了HRM筛查NRAS和KRAS基因突变的方法，该方法具有快速，高通量，灵敏度高的特点，可用于白血病患者的临床检测。第二部分：急性髓系白血病RAS基因突变分析目的：应用高分辨熔解曲线分析（HRM）及DNA直接测序法检测504例中国AML患者的NRAS和KRAS基因所有热变区的突变状态，分析其在中国AML患者的突变率，突变谱，以及与AML临床特征的关系。方法：收集504例急性髓系白血病患者的初诊骨髓液，分离骨髓单个核细胞并提取基因组DNA，设计扩增NRAS和KRAS基因热变区：密码子12，13，和61的HRM引物，分别进行PCR扩增，将PCR产物进行HRM分析筛选突变标本。将阳性标本进一步PCR扩增行DNA测序验证。了解RAS基因突变在中国AML患者中的突变率和突变谱，比较RAS基因突变阳性和阴性患者之间骨髓细胞形态学，遗传学及临床资料的差异，分析RAS基因突变在AML患者中的预后意义。结果：1.在504例中国成人AML患者中，61（12%）名患者伴有RAS基因杂合突变，无纯合突变。其中NRAS和KRAS突变率分别为9.7%（49/504）和2.9%（15/504）。2.DNA测序显示，c.35G>A (rs121913237: G>A; p.Gly12Asp和rs121913529:G>A; p.Gly12Asp)和c.38G>A (rs121434596: G>A; p.Gly13Asp和rs112445441:G>A; p.Gly13Asp)是最常见的碱基置换类型，导致甘氨酸被替换成天冬酰胺。3.伴RAS基因突变的AML患者外周血白细胞计数明显高于无RAS基因突变的患者，在去除预后良好核型组后进行比较，两组差异仍具有显著性（P<0.05）。在中位年龄，性别比例，中位外周血血红蛋白浓度及血小板计数上，两组之间无显著性差异。4.RAS基因在FAB亚型M4和M5中的突变率（分别为21.6%和20.6%）明显高于其他亚型（7.5%，P=0.006和0.005）。相反的，RAS基因突变少见于M3型（2.5%，P=0.004）。5.RAS基因突变在不同预后核型组间的分布具有显著性差异（P=0.02）。在伴有11q23异常或inv(16)的患者中，RAS基因突变率明显高于总体的RAS基因突变率（分别是50%和66.6%，P=0.002和0.04）。6.FLT3-ITD在伴有RAS基因突变患者中的发生率明显低于在无RAS基因突变的患者中的发生率（5%和15%，P=0.03）。NPM1基因突变与RAS基因突变无相关性。7.无论是在总体AML患者中，还是在各种不同的预后分组及单核细胞白血病组中，RAS基因突变不影响患者的总生存。在正常核型组进行多因素分析显示，仅年龄和FLT3-ITD为独立预后因素。结论：RAS基因在中国AML患者中的突变率和突变谱与西方人群相似，RAS基因突变与特定生物学特征的AML亚群相关，但是对患者总生存无影响。第三部分：PHLPP1在慢性髓细胞白血病中的作用目的：研究PHLPP1对慢性髓细胞白血病（CML）细胞株K562细胞增殖，细胞周期及细胞凋亡等细胞生物学的影响及PHLPP1在CML原代细胞中的表达。方法：QRT-PCR和Western-blotting检测急性髓系白血病细胞株THP1，HL-60和慢性髓细胞白血病细胞株K562，Meg01以及原代细胞中PHLPP1的表达；应用Lipofectamine2000将真核过表达载体PCDNA3.0-PHLPP1转染K562细胞，建立过表达PHLPP1的稳定转染细胞株K562-PHLPP1;台盼蓝拒染法绘制细胞生长曲线；流式细胞仪检测细胞周期，细胞凋亡；定量PCR检测慢性髓细胞白血病原代细胞中miR190的表达。结果：1.QRT-PCR及Western-blotting显示慢性髓细胞白血病细胞株K562，Meg01较急性髓系白血病细胞株THP1，HL-60中PHLPP1表达水平明显下调（P<0.01）。2.QRT-PCR及Western-blotting鉴定过表达PHLPP1稳定转染细胞株显示，K562-PHLPP1细胞株内PHLPP1水平较转染对照细胞株K562-control显著升高（P<0.01），表明建株成功。3.过表达PHLPP1的K562细胞增殖速度较K562转染对照细胞减慢，培养48小时后两者细胞计数具有显著性差异（p<0.05）。4.过表达PHLPP1的K562细胞细胞周期G1/S比例（0.695±0.026）明显高于K562转染对照细胞（0.416±0.019）（P<0.05）。在血清饥饿状态下结果相似。5.仅仅过表达PHLPP1不足以诱发K562细胞凋亡，但能明显增强伊马替尼诱导的K562细胞凋亡。应用1.0μM伊马替尼作用于K562-PHLPP1及K562-control细胞，分别在作用0h，24h，48h，72h检测细胞凋亡率，发现两组细胞早期凋亡率均随作用时间延长而增高，在伊马替尼作用48小时后，K562-PHLPP1细胞早期凋亡率明显高于K562-control细胞（P<0.05）。6.经2.0μM伊马替尼作用于K562细胞0h，12h，24h，36h，细胞内PHLPP1蛋白水平在12h即明显升高（P<0.05），36h达到最高（P<0.01）。7.QRT-PCR显示,CML原代细胞内PHLPP1平均水平与K562细胞株一致（P>0.05），较急性髓系白血病细胞株THP1明显减低（P<0.01）。Western-blotting结果与QRT-PCR结果相符。8.CML原代细胞内miR190表达水平与PHLPP1表达水平无相关性(r=－0.07,P=0.78)。结论：1.PHLPP1在CML细胞株K562中低表达，过表达PHLPP1可通过阻滞K562细胞周期于G1期抑制细胞增殖；2.仅仅过表达PHLPP1不足以诱发K562细胞凋亡，但明显增强伊马替尼诱导的K562细胞凋亡，伊马替尼能上调K562细胞内源性PHLPP1的表达。3.CML原代细胞内PHLPP1表达水平减低，与miR190表达无相关性。