研究背景现代人生活水平在不断提高，但人们的饮食结构及生活方式却出现了严重失衡，越来越多的人处在不健康的生活方式中，肥胖这一非传染病发病的重要危险因素，已严重威胁着人类健康。肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态，脂肪细胞数目的增多与肥大是导致肥胖的重要原因。脂肪组织是肥胖的靶器官,其主要作用之一就是调控体重，而甘油三酯则是肥胖的分子基础，脂肪组织能分泌许多被称为脂肪细胞因子的活性物质，在维持能量及心血管的内环境稳定、葡萄糖及脂质代谢、免疫应答等方面发挥重要作用，与肥胖、糖尿病和心血管等胰岛素抵抗导致的代谢综合征疾病密切相关。脂肪组织包括脂肪细胞，前脂肪细胞，微血管内皮细胞和细胞外基质，脂肪组织的多少主要取决于脂肪细胞的数量和体积，传统减肥方法主要通过减少能量的摄入和增强锻炼，但是脂肪细胞的数量并未因此减少，大多出现反弹，收效甚微，因此，如何减少脂肪细胞的数量成为我们关注的焦点，由于前脂肪细胞的分裂和分化使脂肪细胞数目增加，而前脂肪细胞和脂肪细胞的凋亡则使得脂肪细胞数目减少，因而抑制前脂肪细胞向脂肪细胞分化或促进前脂肪细胞和脂肪细胞的凋亡可以达到减少脂肪组织的目的，同时由于减少脂肪组织的过量蓄积，从而降低导致胰岛素抵抗，对于肥胖、糖尿病及心血管疾病等代谢综合征疾病的防治具有重要意义。中药荜茇具有温中散寒、行气止痛功能。临床用于治疗胃脘痛、呕吐、泄泻、脐腹痛、牙痛、头痛等，蒙医还用于治疗冠心病。从荜茇中提取出的胡椒碱，具有显著的降血脂活性。前期研究发现，中药荜茇醇提物在大鼠胰岛素抵抗模型上具有改善胰岛素抵抗的生物活性[1,2]。本课题在前期研究基础上，继续研究筚茇的主要活性成分胡椒碱（Piperine，PIP）对3T3-L1前脂肪细胞的干预作用，探索胡椒碱对脂肪细胞的调节机制。目的1.研究并探讨PIP对正常3T3-L1前脂肪细胞生长的影响和作用。2.研究并探讨PIP对正常3T3-L1前脂肪细胞生长抑制的作用是否通过凋亡途径。为下一步深入研究PIP改善胰岛素抵抗的细胞分子机制提供实验依据。方法1. MTT法检测不同PIP浓度下的细胞抑制率活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。根据测得的吸光度值（OD值）观察PIP不同浓度和作用不同时间后对3T3-Ll前脂肪细胞增殖的影响，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。由计算机拟合曲线可以得到PIP作用于3T3-L1的IC50，为下面的实验奠定基础。2.单细胞凝胶电泳法检测细胞凋亡单细胞凝胶电泳法可检测含有大量DNA碎片的凋亡细胞。有核细胞的DNA分子量很大，在DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中。通过荧光显微镜观察，可以从形态学上区分正常细胞与凋亡细胞。3.流式细胞法检测细胞凋亡相关指标通过对细胞周期的检测、磷脂酰丝氨酸外翻分析和线粒体膜电位的检测进行分析，可以将坏死细胞和凋亡细胞定量的区分开来，观察PIP对脂肪细胞凋亡的影响。结果1.3T3-L1前脂肪细胞的培养：通过细胞形态特征比较鉴定结果，实验中培养出的细胞为正常的3T3-L1前脂肪细胞，为下一步实验奠定基础。2.胡椒碱对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响不同浓度的胡椒碱对3T3-L1前脂肪细胞的活力有抑制作用，且呈一定的量效关系。胡椒碱作用24h后，10μM以上浓度的胡椒碱对吸光值影响具有显著性差异，通过软件拟合曲线，得到细胞生长抑制率IC50的胡椒碱浓度为108.7μM，提示高浓度胡椒碱对3T3-L1前脂肪细胞有较强的抑制的作用；胡椒碱作用48h后，对3T3-L1前脂肪细胞的抑制作用过强，对细胞损伤较大。3.胡椒碱对3T3-L1细胞凋亡作用的影响不同浓度的胡椒碱作用下的3T3-L1细胞出现早期凋亡现象，且呈一定的量效关系：胡椒碱作用24h后，40μM组与80μM组的凋亡细胞数与control组相比具有显著性差异（P＜0.05）；胡椒碱作用48h后，20μM、40μM组和80μM组的凋亡细胞数与control组相比均有显著性差异（P＜0.001）。提示胡椒碱可以诱导3T3-L1前脂肪细胞凋亡。4.胡椒减对3T3-L1前脂肪细胞凋亡作用的机制探讨在胡椒碱的作用下，3T3-L1前脂肪细胞的细胞周期发生了变化，尤其是40μM组和80μM组细胞的状态出现异常，可能影响细胞S期的关键控制点，阻断DNA的合成和复制，从而阻滞细胞周期的进程。线粒体膜电位的改变是细胞发生凋亡的早期事件，在胡椒碱的作用下，3T3-L1前脂肪细胞的线粒体膜电位呈剂量依赖性地降低，20μM组、40μM组和80μM组与control组相比均有显著性差异（P＜0.05）。结论胡椒碱对小鼠的3T3-L1前脂肪细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用，且呈一定的量效关系。作用机制可能是胡椒碱通过激活线粒体通路，以及阻断DNA合成和复制，对S期的细胞周期的阻滞作用而抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖，且可促进细胞凋亡。由于高浓度胡椒碱溶液有较强的细胞毒性，故应进一步研究其在低浓度下对代谢疾病的影响和机制。