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动物乳腺生物反应器是利用乳腺特异性调控元件驱动外源基因表达,从而在乳汁中获得有价值的重组蛋白的基因工程技术。在目前普遍使用的基因编辑技术中,CRISPR/Cas9技术因其靶向性强、剪切效率高,在基因定点敲除和敲入方面显示出极大优势。本文利用CRISPR/Cas9介导的同源打靶技术,对乳腺特异性表达人胰岛素的转基因动物制备进行了初步研究。本研究选择以牛β-casein第二外显子为外源基因插入位点,新霉素抗性基因neo表达框架PIII-EGFP-PGK-Neo质粒为骨架,通过PCR分别扩增奶牛β-casein第二外显子5’同源臂CNS2LA、3’同源臂CNS2RA,hINS基因,负筛选基因DTA和bGH PolyA序列,并按顺序与质粒PIII-EGFP-PGK-Neo连接,最终构建全长9kb,以DTA为负筛选标记,CNS2LA和CNS2RA为同源臂,hINS为目的基因,bGH PolyA序列为转录终止信号的乳腺组织特异性表达人胰岛素的同源打靶载体；同时在牛P-casein第二外显子设计3对sgRNA序列,构建CRISPR/Cas9定点切割载体。经限制性内切酶酶切和DNA序列测序表明,同源打靶载体和CRISPR/Cas9切割载体构建成功。通过脂质体法将同源打靶载体和CRISPR/Cas9定点切割载体共转染牛成纤维细胞,经流式细胞仪分选获得单克隆细胞,利用PCR扩增和DNA测序鉴定,筛选出6株发生同源重组的单克隆细胞。为验证转染后hINS基因的表达,本研究利用脂质体法将同源打靶载体转染牛胎儿成纤维细胞和乳腺上皮细胞,并通过β-casein诱导液对转染后细胞进行24h诱导培养,RT-PCR检测细胞hINS mRNA的表达,结果表明,牛胎儿成纤维细胞在诱导前后hINS mRNA表达差异不显著,而乳腺细胞经过诱导后hINS mRNA的表达显著升高,表明所构建的同源打靶载体可以利用β-casein启动子来启动hINS的表达。以上结果为通过体细胞核移植获得乳腺特异性表达人胰岛素的转基因克隆牛研究奠定了基础。