食管癌(Esophageal cancer,EC)是现代临床上比较常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率分别位居世界恶性肿瘤的第七位和第六位,我国食管癌的发病率和死亡率都位居世界第一位。食管癌根据病理分型可以分为食管腺癌和食管鳞癌,在中国,食管鳞癌是主要组织学和流行病学类型。食管癌的发生和发展是多因素和多阶段的,临床上早期发现非常困难,超过九成的食管癌患者确诊时属于中晚期,这也是食管癌死亡率高和预后不好的一个重要原因。目前,临床上食管癌的主要的治疗方法包括化疗、放射治疗、免疫治疗和手术切除,近年来食管癌的诊断和治疗方面取得了一些进展,最新的免疫疗法在癌症治疗中做出了很大的贡献,一些免疫检查点阻断剂或被FDA批准,食管癌患者的生活质量和生存期得到了改善,但是中晚期食管癌患者的五年生存率仍然低于30%,一些诸如药物生物学剂量以及对免疫力要求的问题仍然未解决。因此,食管癌较差的预后,极高的复发率、术后转移以及化疗耐药仍然是我们面临的一个重大难题,寻找高效、低毒副作用的抗肿瘤药物和治疗食管癌的特异的分子靶标十分必要。从天然产物中筛选抗肿瘤活性成分成为癌症研究的一个重要方向,黄酮类化合物广泛存在于多种植物中,具有丰富的药理活性和显著的抗肿瘤作用,并且对正常细胞的毒性作用很小。因此,在本研究前期的试验中共筛选了 50余种化合物,实验结果发现木蝴蝶苷A能够显著抑制食管鳞癌细胞的生长。木蝴蝶苷A是来源于传统中草药植物木蝴蝶的一种有效的黄酮类成分,已有的研究结果表明木蝴蝶苷A对乳腺癌细胞和肺癌细胞有一定的抑制作用,但是未见其对食管鳞癌细胞的作用及机制的研究。本研究用MTT细胞增殖实验、平板克隆实验和软琼脂克隆实验检测木蝴蝶苷A对食管鳞癌细胞生长情况的影响,为了更深入研究木蝴蝶苷A能够抑制食管鳞癌细胞增殖作用的机制,用质谱生物学检测了木蝴蝶苷A处理食管鳞癌KYSE150细胞后蛋白质组学和磷酸化组学的变化,通过生物信息学等分析得到差异表达的蛋白。在本研究中对这些差异蛋白进行了分析和验证,并用下拉实验寻找木蝴蝶苷A可以靶向结合的蛋白,进而揭示木蝴蝶苷A抑制食管鳞癌生长的机制。方法1.细胞IC50和毒性实验:不同浓度的木蝴蝶苷A分别处理食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450,正常细胞SHEE,统计细胞的生存率,选取能够明显抑制肿瘤细胞生长但是对正常食管上皮细胞无明显毒性的浓度。2.细胞增殖实验:不同浓度的木蝴蝶苷A(0,2.5,5,10,20 μM)分别处理食管鳞癌细胞KYSE140,KYSE150,KYSE410,KYSE450,评价木蝴蝶苷A对食管鳞癌细胞增殖作用的影响。3.软琼脂克隆形成实验:不同浓度的木蝴蝶苷A(0,2.5,5,10,20 μM)分别处理食管鳞癌细胞KYSE150,KYSE450,评价木蝴蝶苷A对食管鳞癌细胞克隆形成能力的影响。4.平板克隆实验:不同浓度的木蝴蝶苷A(0,2.5,5,10,20 μM)分别处理食管鳞癌细胞KYSE150,KYSE450,评价木蝴蝶苷A对食管鳞癌细胞生长和增殖能力的影响。5.蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学:木蝴蝶苷A(0,10 μM)处理食管鳞癌细胞KYSE150 24 h后,进行质谱分析和蛋白质组学磷酸化蛋白质组学分析,检测化合物处理细胞后引起的蛋白分子和磷酸化位点修饰的改变。6.免疫印迹Western blot实验:利用免疫印迹实验验证木蝴蝶苷A处理食管鳞癌细胞后其磷酸化蛋白修饰位点STAT3Tyr705,STAT3Ser727,NFκBSer9(07的改变。7.体内实验:将稳定的人源食管鳞癌组织移植在均一的SCID小鼠(6-8周龄)的背部皮下,成功构建PDX模型并给予不同浓度的木蝴蝶苷A(50mg/kg和100 mg/kg)腹腔注射处理。评价木蝴蝶苷A在体内抑制食管鳞癌肿瘤增殖的作用效果。8.免疫组织化学染色(IHC)实验:检测PDX模型实验中不同处理后的小鼠肿瘤组织中蛋白磷酸化水平变化(STAT3 Tyr705,STAT3Ser727,NFκBSer907)。9.下拉实验:检测可以和木蝴蝶苷A相结合的蛋白,寻找潜在的靶点。10.细胞周期实验:检测木蝴蝶苷A对细胞周期的影响。结果1.细胞IC50和毒性实验:细胞生存率在50%左右的适当浓度为20 μM,且对正常细胞没有毒性作用。2.细胞增殖实验:与对照组相比,不同浓度的木蝴蝶苷A(2.5,5,10,20 μM)能够有效抑制食管鳞癌细胞KYSE140,KYSE150,KYSE410,KYSE450的增殖。3.软琼脂克隆形成实验:与对照组相比,不同浓度的木蝴蝶苷A(2.5,5,10,20 μM)能够有效抑制食管鳞癌细胞KYSE140,KYSE150,KYSE410,KYSE450的克隆形成能力。4.平板克隆实验:不同浓度的木蝴蝶苷A(2.5,5,10,20 μM)能够有效抑制食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450的平板克隆形成的能力。5.磷酸化蛋白质组学分析:木蝴蝶苷A 10μM浓度处理食管鳞癌细胞KYSE150后,病毒致癌作用通路,糖尿病并发症中晚期糖基化-晚期糖基化通路,EB病毒感染通路,细胞因子信号通路等均有显著性下调,这些通路综合分析发现STAT3Tyr705,STAT3 Ser727,NFκBSer907磷酸化水平发生显著性下调。6.免疫印迹Western blot实验:免疫印迹Western blot实验证明木蝴蝶苷A处理食管鳞癌KYSE150细胞后,磷酸化蛋白水平发生下调变化,进一步验证了磷酸化组学的结果。7.体内实验PDX模型实验结果表明,木蝴蝶苷A能够有效抑制小鼠PDX模型中食管鳞癌肿瘤组织的生长,且小鼠体重没有明显的下降。8.免疫组织化学染色(IHC)实验:木蝴蝶苷A处理过的PDX小鼠模型的肿瘤组织,IHC实验结果表明STAT3Tyr705,STAT3 Ser727,NFκBSer907磷酸化蛋白水平下降。9.下拉实验:实验结果表明木蝴蝶苷A可以和STST3上游的蛋白JAK2结合,有可能是潜在的靶点。10.细胞周期实验:实验结果表明木蝴蝶苷A处理食管鳞癌细胞后可以将细胞周期阻滞在G0/G1期。结论木蝴蝶苷A可以通过与JAK2靶向结合,在细胞和组织中下调STAT3Tyr705,STAT3 Ser727,NFKBSer907的磷酸化水平,阻滞细胞周期在G0/G1期,进而在体内和体外实验中有效抑制食管鳞癌的增殖。