目的环境内分泌干扰物(EDCs)是能改变机体内分泌功能并对机体、后代或(亚)群引起有害效应的一类化学物质。氰戊菊酯(Fenvalerate, Fen),II型拟除虫菊酯类杀虫剂,从上世纪70年代以来已在全世界范围内被广泛使用于农业生产和家庭日常生活。世界卫生组织(WHO)在1990年将其列为II级中等有毒害性农药。最近的一些研究提示,Fen能影响人体多系统包括生殖内分泌系统在内的健康,但其具体的作用机制尚不明确。本课题将致力于探讨氰戊菊酯对女性子宫肌瘤发生、发展的影响,以及对雄性生精功能的影响；并进一步探讨其可能的机制。本研究将为深入了解氰戊菊酯的生殖毒性机制提供科学依据。材料与方法本试验采用培养的人子宫肌瘤细胞(UtLM Cells)及人子宫平滑肌细胞(UtSMCs)作为体外研究子宫肌瘤的模型,通过观察细胞的增殖和细胞外基质的产生来评估氰戊菊酯对子宫肌瘤发生、发展的影响；运用RT-PCR及Western Blot等方法检测氰戊菊酯对p27表达的影响。通过腺病毒转染系统过表达p27、通过特异性siRNA降低p27表达,探讨p27在氰戊菊酯引起的UtLM/UtSMC细胞效应改变中的作用。在男性生殖毒性研究中,采用雄性小鼠灌胃染毒模型,观察了氰戊菊酯对整体动物生精功能等的影响,并观察了对睾丸钙调蛋白(CaM)表达的影响；试验了不同方法培养急性分离的精母细胞；并在培养的GC-2细胞上观察了氰戊菊酯对钙调蛋白表达及对胞内游离钙离子浓度的影响。结果(1)10 μM、100μM Fen分别处理24小时后,UtLM细胞增殖指数升高；而UtSMC细胞在0.1～100 μM Fen处理24小时后细胞增殖指数也升高。0.1 μM Fen处理24小时,UtSMC细胞的增殖指数明显增高(Fen处理组vS.对照组,P<0.05)。与对照组相比,Fen处理的UtLM细胞和UtSMC细胞的BrdU标记率均升高。细胞周期分析显示10μM Fen处理24小时后,UtLM细胞和UtSMC细胞S期比例升高。10μM Fen处理24小时后,与正常对照组相比,UtLM和UtSMC细胞凋亡比例显著降低。(2) 10μM Fen分别处理UtLM和UtSMC细胞24小时后,I型胶原蛋白的mRNA表达水平升高,呈时间依赖性趋势。Fen能够促进UtLM细胞和UtSMC细胞裂解液及细胞上清液中I型胶原蛋白水平表达增加,且此结果呈浓度依赖性。(3)10 nM的E2可以促进ERE介导的荧光素酶的活性增加至6.14倍。这一作用可以被1.0μM的ICI 182,780显著抑制(7.95%,ICI处理组vs.溶剂对照组,P<0.05)。 但0.1μM、1.0μM和10 μ.M的Fen处理两种细胞24小时均未能明显升高荧光素酶的活性。接着,利用极化荧光分析技术测定了Fen与ERα或ERβ的竞争性结合力,发现1nM到262.1 p.M的Fen与ERa或ERβ的结合力几乎不可观察。这些结果提示,ERa或ERp可能不参与Fen对UtLM和UtSMC的影响。(4)10 [M Fen处理UtLM和UtSMC细胞10分钟、1小时、24小时后,p27 mRNA表达呈时间依赖性下降趋势。在Confocal荧光显微镜下观察发现,p27表达主要位于细胞核内,并有少量表达于细胞胞浆。10μM Fen处理UtLM和UtSMC细胞24小时后,核内p27阳性染色强度明显下降。(5)应用Adenovirus-p27 (Adp27) Tet-off表达系统人为提高UtLM和UtSMC细胞内p27的表达。结果发现,转染4小时后,细胞内p27的表达明显增加。Fen可引起正常UtLM和UtSMC细胞分别126.97±6.34%和133.33±4.93%的增殖。而转染Adp27后,这种增殖效应被完全消除。与之相反的是,当系统里加入1 μg/ml Doxycycline (Dox)抑制外源性p27表达时,Fen的增殖效应又可恢复,Fen可引起UtLM和UtSMC细胞分别125.00±4.97%和132.43±8.32%的增殖。同时Fen可引起正常UtLM和UtSMC细胞CDK2基因mRNA分别提高170.28±12.53%和170.28±17.58%。转染Adp27后,Fen不能引起相应的CDK2基因mRNA的变化。而Dox加入后抑制外源性p27表达时,Fen的增殖效应又可恢复,Fen可引起UtLM和UtSMC细胞内CDK2 mRNA的表达分别增高至166.81+22.95%和189.25±5.61%。(6)采用化学合成的抗p27 siRNA下调细胞内p27的表达,发现siRNA干预可以明显降低UtLM和UtSMC细胞内p27 mRNA的表达,分别降至28.62+3.00%和34.36+3.71%,同时明显提高UtLM和UtSMC细胞的增殖率。而当细胞培养基中同时存在10 μM Fen时,anti-p27 siRNA还可以进一步降低UtLM细胞和UtSMC细胞中p27 mRNA,同时UtLM和UtSMC细胞的增殖率分别增强至126.42±4.99%和125.52±5.02%。(7)在体实验中,首先测定氰戊菊酯对ICR雄性小鼠的经口半数致死量。结果发现,LD50为185.62 mg/kg.bw。在LD5o范围内,37.12 mg/kg.bw的Fen处理组的小鼠的平均睾丸脏器指数(6.21±0.54mg/g.bw)与对照组(7.41±0.57mg/g.bw)相比,呈显著性降低。并伴有精子活动率的下降以及头部畸形率增加。HE染色睾丸组织切片发现经氰戊菊酯处理后的小鼠睾丸出现灶性生精细胞层次减少,次级精母细胞脱落,细胞稀疏。随氰戊菊酯染毒剂量的增加,小鼠睾丸病变逐渐加重,出现广泛性的生精细胞层次减少稀疏,细胞仅剩2-3层。脱落细胞主要为次级精母细胞和精子细胞,并出现生精细胞空泡样改变。(8)正常对照组小鼠睾丸组织上可见CaM表达,但各级生精细胞上CaM表达存在差异,其中粗线期精母细胞表达最多,而精子细胞和精子基本不表达。相应的,氰戊菊酯处理组小鼠睾丸的组织切片中可以观察到CaM的阳性染色信号进一步增强。氰戊菊酯处理组睾丸匀浆组织中CaM的mRNA表达随处理剂量升高而增加。采用免疫印迹方法来检测睾丸组织CaM的蛋白表达改变。结果显示CaM的蛋白条带随暴露剂量增加而不断加深。(9) Percoll梯度离心分离精母细胞实验中,首先运用胶原蛋白酶和DNase I的组合酶消化磨碎的小鼠睾丸组织30分钟后,经台盼蓝染色发现所得细胞群活性达97%以上。在此基础上,接下来采用非连续Percoll梯度分离方法进一步纯化所得的细胞组分。将所获得的细胞组培养3小时后,细胞依然能维持正常形态；但培养24小时后,较大部分细胞死亡,细胞脱壁,可见较多细胞碎片。而48小时后,绝大部分细胞已完全不贴壁。这一结果提示急性分离的精母细胞不适合于下一步的研究方案。(10)5 μM的氰戊菊酯处理GC-2细胞后,细胞形态与对照组无明显差异。正常GC-2细胞可见CaM的表达,而5 μM的氰戊菊酯处理GC-2细胞24小时,CaM阳性信号强度明显增加。而免疫印迹结果提示,5 μM氰戊菊酯处理后,CaM的蛋白表达于8小时起开始增高。5州的氰戊菊酯处理GC-2细胞6小时后,CaM的mRNA表达水平开始上升,12小时和24小时后表达显著提高,分别为对照组的1.90+0.15倍和2.11±0.13倍(P<0.05)。(11)运用钙离子探针Fluo-3,AM标记胞内游离钙,观察到5μM的氰戊菊酯能.够引起细胞内钙离子浓度升高。利用不含钙的胞外缓冲液,氰戊菊酯仍然可以使胞内钙升高；接着用2μM thapsigargin (TG)预处理GC-2细胞30分钟以清空内质网钙池,氰戊菊酯依然能引起胞内钙离子浓度升高。揭示胞外钙离子的内流、胞内钙释放均参与了氰戊菊酯引起胞内钙离子的增加。结论1.氰戊菊酯可以在一定浓度范围内诱导子宫肌瘤细胞、子宫平滑肌细胞的增殖及胞外基质成分合成增加,是子宫肌瘤的潜在危险因素；p27下降介导了氰戊菊酯引起的这一变化。2.氰戊菊酯可以损伤雄性小鼠的生殖系统,伴有睾丸局部钙调蛋白表达增加；在培养的雄性生殖细胞中,氰戊菊酯可增加钙调蛋白表达及增强胞内游离钙离子浓度。