酶法制备κ-新卡拉四、六糖的化学及生物学研究

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经过多次富集和反复筛选,从海洋环境中筛选到69株具有卡拉胶降解活性的菌株,以产酶活力高、生物学性状优良的MCA-2菌株(Cytophaga)为出发菌株,进行复合诱变和自然选育,获得了一株酶活显著提高的突变株M2-4-4,发酵液产酶活力达到66U/ml。实验确定M2-4-4菌株的最适产酶培养基成分为:NaCl浓度15‰,卡拉胶2‰,NaNO32‰,酵母膏1‰;最适培养条件为:摇瓶转速150r/min,培养基起始pH值7.5,培养温度32℃。液体发酵制备出卡拉胶降解酶液,通过Q-Sepharose FF层析和Sephacryl S-100HR凝胶过滤技术对卡拉胶酶进行纯化和精制,获得电泳纯度的酶蛋白组份,SDS-PAGE确定酶蛋白的分子量为30kDa。确定该酶反应的最适温度为32-38℃,最适pH范围为6-8,K+和Ca2+对酶活具有一定程度的促进作用,而Al3+、Hg2+和Pb2+则强烈抑制酶活。该酶经55℃处理30min或60℃处理10min后酶活将完全丧失,在中性环境中(pH5-8)酶活稳定。通过Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析技术对卡拉胶的酶解终产物进行纯化,获得两个单一组份,采用MALDI-TOF-MS、红外光谱、13C-NMR技术确定酶解产物的组成和结构。该酶为专一性内切酶,专门水解3,6-内醚-D-半乳糖和D-半乳糖之间的β-1,4-糖苷键,最后形成以κ-新卡拉四糖和κ-新卡拉六糖为主的终产物。 对酶解低聚糖及其磺化衍生物的生物学活性进行实验。重均分子量为1726,硫含量为15.1%的新卡拉低聚糖对小鼠S180具有明显的抗肿瘤活性,处理剂量为100mg/kg时的抑瘤率达到78.2%。新卡拉低聚糖可以明显促进荷瘤小鼠体内的SOD和CAT活性,可能在抗肿瘤活动中发挥重要作用。体外抗氧化实验发现,新卡拉低聚糖能够抑制Fe2+诱发的卵黄脂蛋白过氧化现象,对H2O2+Fe<sup>2+诱发产生的羟自由基产生明显的清除作用,并且清除效果同样品的浓度呈明显的正相关现象,能抑制由H2O2导致的红细胞溶血现象,抑制由邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子。新卡拉低聚糖能够在一定程度上抑制由环磷酰胺引起的小鼠免疫功能低下,实验组小鼠巨噬细胞的吞噬功能明显高于对照组,并能够显著提高血清溶菌酶的活性。
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