EGF通过间隙连接蛋白调控卵母细胞成熟的研究

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目的:  对表皮生长因子(EGF)促进小鼠卵母细胞减数分裂恢复、促进卵母细胞成熟机理进行研究探讨。  方法:  利用RT-PCR技术检测与卵母细胞成熟、胚胎发育相关的11种间隙连接蛋白(Connexin,Cx)在小鼠未成熟卵母细胞复合体(COCs)和成熟COCs中的表达情况;利用免疫组化结合激光共聚焦技术研究Cx43在未成熟COCs和成熟COCs颗粒细胞、卵母细胞中的表达部位。将超促排卵得到的未成熟COCs培养于含有或不含有EGF的HX-M199培养液中,制备EGF诱导小鼠COCs减数分裂恢复的动力学曲线,比较不同浓度EGF促进小鼠COCs发生减数分裂恢复的效率,通过添加EGFR特异性抑制剂AG研究EGF是否通过EGFR发挥作用。通过Western blotting技术检测EGF作用后Cx43的磷酸化水平,确定EGF是否促进Cx43发生磷酸化,使颗粒细胞与卵母细胞间的间隙连接通讯(GJIC)关闭,阻断抑制卵母细胞减数分裂恢复信号物质的传递,使小鼠卵母细胞成熟。  结果:  1.在未成熟卵母细胞复合体中,有8种间隙连接蛋白Cx30、Cx30.3、Cx31、Cx31.1、Cx37、Cx40、Cx43和Cx45表达,其中Cx37、Cx43和Cx45高度表达,Cx31、Cx31.1中度表达,Cx30、Cx30.3和Cx40低度表达。在成熟卵母细胞复合体中,间隙连接蛋白表达种类和表达量均有减少,仅有4种间隙连接蛋白Cx32、Cx37、Cx43和Cx45表达,其中Cx43和Cx45高度表达,Cx37中度表达,Cx32低度表达。说明Cx在抑制小鼠卵母细胞成熟中起着重要作用。  2.在未成熟COCs中Cx43高表达于颗粒细胞细胞膜上,在卵母细胞细胞膜和透明带上也有高表达,以簇状分布。在成熟的COCs颗粒细胞中Cx43表达量降低,仍然分布于细胞膜上,在卵母细胞中Cx43的表达量亦减少,均匀分布于细胞膜上,在透明带上不表达。  3.与对照组比较,EGF能有效的促进小鼠卵母细胞的成熟,且具有时间依赖性和剂量选择性,10ug/mlEGF培养24h作用效果最好,GVBD发生率达到86.2%。EGF不能促进裸卵减数分裂的恢复。EGFR特异性抑制剂AG能有效逆转EGF促进的小鼠卵母细胞减数分裂的恢复,且1ug/mlAG逆转效果最好。  4.在卵母细胞成熟过程中,均有Cx43磷酸化和非磷酸化形式存在,在未成熟COCs中,Cx43以非磷酸化形式为主,添加EGF后,仅仅培养10min,Cx43就以磷酸化形式为主,并且持续1小时,培养到2h时,Cx43又以磷酸化和非磷酸化两种形式存在。  结论:  在小鼠未成熟COCs中,多种Cx在颗粒细胞和卵母细胞细胞膜上表达,在颗粒细胞间、颗粒细胞与卵母细胞间形成了GJIC。EGF能够促进小鼠卵母细胞的成熟,其作用机制可能是EGF与颗粒细胞中的EGFR结合,快速促使小鼠颗粒细胞和卵母细胞中Cx43发生磷酸化,GJIC关闭,阻断了抑制卵母细胞成熟的信号物质cAMP和cGMP从颗粒细胞向卵母细胞的输入,卵母细胞中cAMP和cGMP浓度降低,减数分裂恢复,卵母细胞走向成熟。
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