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乙烯作为一种植物激素,对植物种子萌发、生长发育、衰老、果实成熟、性别决定等都有着重要的影响,同时参与抵抗逆境胁迫如机械伤害、冷害、渍水、病原菌入侵等以及参与植物细胞的程序性死亡。ACC合酶是乙烯合成途径中的限速酶,本实验室在前期研究中利用致病疫霉接种不同生态型拟南芥,初步确定ACC合酶中的ACS9基因为抗致病疫霉相关基因。为了深入研究ACC合酶参与抗致病疫霉的机制和信号传导途径,本试验利用反义RNA和RNAi技术对ACS9基因功能进行了初步研究。克隆了ACS9基因上游不同长度的调控序列,并构建了GUS表达载体,研究了该基因的表达特性。结果如下:
(1)构建了ACS9基因反义RNA和RNAi载体pCAMBIA1300-ACS9A和pCAMBIA1300-ACS9i。将pCAMBIA1300-ACS9A和pCAMBIA1300-ACS9i载体经农杆菌介导转化拟南芥。通过潮霉素筛选,得到了18株反义RNA转化子和13株RNAi转化子。经PCR鉴定,外源基因已成功整合到了转基因植株的基因组中。RT-PCR结果表明,转基因植株中ACS9基因的表达均受到不同程度的抑制,确定所得转基因植株均为ACS9基因的(反义RNA/RNAi)突变体。
(2)经RT-PCR分析发现,突变体病害防御反应中乙烯信号转导途径的下游基因PDF1.2的表达受到了抑制;对突变体进行暗培养,“三重反应”消失;突变体接种致病疫霉后表现感病症状,确定ACS9基因参与了调控拟南芥中乙烯介导的病害防御反应。
(3)用PLACE和PLANTCARE软件分析ACS9基因的启动子,发现该序列具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,此外还发现了光应答元件G-Box、GATA和刺激诱导元件MBS和LTR等多个顺式作用元件。
(4)成功构建了带有GUS报告基因的含有ACS9基因不同长度调控序列的植物表达载体,发现不同长度的调控序列均具有启动子活性;GUS瞬时表达定量检测与组织化学染色结果表明长度为953 bp的调控序列启动子活性最强,推测ACS9基因上游953 bp~1 232 bp之间可能存在负调控元件。