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疯草是世界范围内危害草原畜牧业生产最为严重的一类毒草,广泛分布于我国西部和美国、俄罗斯、澳大利亚、加拿大等国家,给畜牧业生产造成巨大损失。因为疯草的粗蛋白含量与苜蓿相当,具有着作为优良饲草的潜力。为防治疯草中毒和综合利用疯草,学者们从不同思路和角度出发进行研究。疯草的主要有毒成分是苦马豆素(swainsonine, SW),从免疫学角度讲,SW可以作为半抗原,与大分子载体蛋白偶联,化学合成为人工抗原,并制成疫苗,诱导机体产生特异性抗体,使动物获得免疫力并在采食疯草时得到保护。本论文的目的在于将SW与大分子蛋白(HSA)偶联得到不同结合率SW-HSA,并制成疫苗接种小鼠,以研究不同结合率疫苗对小鼠的免疫原性,探讨哪一种结合率的疫苗产生的免疫原性好,为以后建立单链抗体(ScFv)库奠定基础。论文系统地研究了苦马豆素(半抗原)纯品的制备,进行了4种不同结合率SW-HSA的合成及其免疫原性研究。结果如下:1变异黄芪中苦马豆素的分离、鉴定本试验是为苦马豆素免疫原合成提供原料。以变异黄芪干草粉为材料,用工业酒精热回流提取后减压回收溶剂,浸膏用1 mol/L HCl酸化,氯仿萃取除去杂质,水液部分用固体NaOH或浓NH3·H2O调pH至9-10,再用正丁醇萃取6-7次,回收正丁醇得到总生物碱,将总生物碱硅胶拌样,硅胶柱层析,洗脱剂洗脱,TLC检测,同类合并,挥干后再经氨性氯仿处理。将氨性氯仿部分干燥后100℃油浴减压升华得到白色针状结晶,经TLC、MP、IR、MS分析鉴定为苦马豆素。2苦马豆素-HSA的合成研究将SW与活性酯在70℃条件下反应制备季铵盐,然后将季铵盐与HSA冰浴搅拌反应12 h,通过调节季铵盐与HSA的摩尔比制备SW-HSA,透析并冷冻干燥,采用紫外分光光度法测定SW-HSA偶联率。得到偶联率分别为18.6、12.5、13.5和32.6的SW-HSA。3苦马豆素-HSA的免疫原性研究将20只昆系小白鼠随机分为A、B、C、D和E组,每组4只,分别编号为A1～A4、B1～B4、C1～C4、D1～D4和E1～E4。用4种不同偶联率的SW-HSA对前4组小鼠进行免疫,E组空白对照。首次免疫时,在小鼠颈部两侧、背部及后腿内侧分5点皮下注射福氏完全佐剂乳化制备的抗原液,抗原量为0.050 mg/只,第30 d进行第2次免疫,福氏不完全佐剂乳化制备抗原液,抗原量与首免相同,以后每隔20 d进行1次,抗原量均为前一次免疫所用抗原量的1.5倍,注射用生理盐水溶解后免疫小鼠,前5次免疫途径与首免相同,第6次免疫途径为背部皮下和腹腔内注射,第7次免疫途径为腹腔内注射,共免疫7次。E组注射等量生理盐水。从第3次免疫后ELISA检测血清中抗SW抗体效价。ELISA测定结果显示,从第3次免疫后,A、B、C、D组试验小鼠均产生抗SW抗体,并且抗体效价呈上升趋势,在第5次免疫后,测得A、B、C、D组试验小鼠抗SW抗体效价分别为28、29、29、29,达到最高峰。其中D组的抗SW抗体效价在第4次免疫后首先达到29,并在第5次免疫后维持在相同水平。各组试验小鼠血清的抗SW抗体效价于第6次免疫时开始逐渐下降。试验结果证实,不同偶联率的SW-HSA均可诱导小鼠产生抗体,较大偶联率的SW-HSA可以更好地提高抗SW抗体水平。