【摘 要】
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背景骨骼肌随着年龄的增长及病理条件时会发生损耗和萎缩,但伴随这个过程,骨骼肌卫星细胞会以增殖、分化来实现生理条件下骨骼肌自我更新和病理条件下的修复过程。实际上,骨骼肌纤维再生,首先是肌卫星细胞被激活,激活后的卫星细胞称为成肌细胞;随后成肌细胞经增殖、迁移、融合等过程形成新的肌纤维,但是机制仍不清楚。Ezrin蛋白是广泛存在于肌动蛋白表面的蛋白质,在质膜和肌动蛋白细胞骨架之间起连接作用,将肌动蛋白细
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背景骨骼肌随着年龄的增长及病理条件时会发生损耗和萎缩,但伴随这个过程,骨骼肌卫星细胞会以增殖、分化来实现生理条件下骨骼肌自我更新和病理条件下的修复过程。实际上,骨骼肌纤维再生,首先是肌卫星细胞被激活,激活后的卫星细胞称为成肌细胞;随后成肌细胞经增殖、迁移、融合等过程形成新的肌纤维,但是机制仍不清楚。Ezrin蛋白是广泛存在于肌动蛋白表面的蛋白质,在质膜和肌动蛋白细胞骨架之间起连接作用,将肌动蛋白细胞微丝与细胞膜相连接,调节细胞的形态、运动及黏附,从而参与细胞迁移、信号转导、有丝分裂等重要过程。既往研究表明:Ezrin蛋白与肌无力、肌萎缩、肌营养不良、多发性肌炎都有关。但是Ezrin是否与肌卫星细胞增殖分化有关,未知。目的探索Ezrin对骨骼肌卫星细胞招募、迁移、分化与肌管融合及其肌纤维类型的作用;探索Ezrin对骨骼肌卫星细胞分化的作用与PKA信号途径的关联;Ezrin介导NFAT s活性变化与骨骼肌卫星细胞分化特性的关联机制。方法用C2C12细胞作为实验材料,建立含2%的马血清高糖培养基诱导其分化,培养2、4、6d后用MyHC免疫荧光染色,观察肌管随着时间肌管的融合程度和肌管的形态、数量变化。于2、4、6d收集分化、增殖条件下的C2C12成肌细胞,Westernblot及免疫荧光检测Ezrin的表达水平。分别转染过表达、敲除的Ezrin腺病毒24h以上,诱导其分化,培养2、4、6d后,用MyHC、MyOG、MEF2C免疫荧光染色,观察随着时间积累,Ezrin在调节成肌细胞分化成肌管的作用。过表达/敲低Ezrin后,于分化6d的C2C12成肌细胞进行My32、NOQ免疫荧光染色,观察Ezrin在调节成肌细胞分化称快、慢肌纤维中的作用,采用实时定量荧光PCR（real-time PCR）,检测MyHC1、,MyHC2a、MyHC2b、MyHC2X各指标的m RNA的变化,分析慢（细长）和快（粗短）肌纤维等两种类型的变化特点。检测生肌调节因子MyOD、Myf-5的m RNA的变化。用Western blot检测PKAγ、PKAαcat、PKAα/β/γcat、PKAreg Iα、PKAreg Iβ、PKAreg I Iα、NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4的水平。用PKA抑制剂H-89和PKA激动剂N6-Bz-c AMP来探究Ezrin和PKA变化效应,用Ad-NFATc1、Ad-NFATc2、Ad-sh-NFATc3和Ad-sh-NFATc4证实NFATs与Ezrin介导的C2C12成肌细胞分化和融合的关系。结果（1）Ezrin在C2C12成肌细胞增殖和分化过程中均有表达,具有时间动态特点,逐渐增加,在肌管分化接近成熟的末期,Ezrin的表达量下降。（2）Ad-Ezrin促进C2C12成肌细胞的分化和核融合,肌管的长度,增加肌管的数目,这与MyHC-1的表达幅度增大一致,其中MyOG、MEF2C阳性的肌管中有3个以上细胞核的肌管数量也明显增加。Ad-sh Ezrin明显抑制了C2C12成肌细胞的分化。（3）Ad-sh Ezrin能明显促进成肌细胞的Ⅱ肌纤维的分化,但Ad-Ezrin抑制成肌细胞的II肌纤维的分化。（4）PKA抑制剂H-89能抑制转染Ad-Ezrin的C2C12成肌细胞的分化,PKA激动剂N6-Bz-c AMP能有效逆转Ad-sh Ezrin对C2C12成肌细胞分化和融合的抑制作用。（5）Ad-Ezrin使成肌细胞的NFATc1、NFATc2表达水平增加,Ad-sh Ezrin使成肌细胞的NFATc3、NFATc4表达水平增加。（6）Ad-sh Ezrin对以MyHC、MEF2C及MyOG为特征的成肌细胞分化抑制作用,能被NFATc2过表达和NFATc4敲除逆转。结论（1）Ezrin介导成肌细胞的分化、肌管的融合与PKA-MyOG/MEF2C信号通路有关。（2）Ezrin介导成肌细胞的分化、肌管的融合与NFATc2/c4-MyOG/MEF2C有关。
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