奶牛乳房炎不仅对奶牛业危害十分严重,而且也是导致奶牛淘汰的疾病之一,引起奶牛乳房炎的病原菌除了常见的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌等以外,凝固酶阴性葡萄球菌如木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)引起的感染呈上升趋势,已成为引起奶牛乳房炎发病的新特点。当木糖葡萄球菌产生的多聚复合物基质将自身包绕,黏附于无活性物体或活体表面,形成了有一定结构的细菌群体即生物被膜(biofilm,BF)后,生物被膜内细菌可以抵抗宿主的免疫,同时对抗菌药物产生耐药性,造成乳房炎感染难以治愈,反复发作,由此引发奶牛乳房炎的持续性感染已引起部分学者的关注,成为奶牛乳房炎防治领域研究的新热点。因此,对木糖葡萄球菌生物被膜调控机制的研究,寻找新型药物作用靶标,提高奶牛乳房炎的预防和治疗效果,已成为国内外科研工作者关注的焦点之一。红霉素(erythromycin)属于大环内酯类药物,不仅对革兰氏阳性菌,如葡萄球菌、化脓性链球菌等有较强的抑制作用,而且减少猪链球菌、铜绿假单胞菌和某些表皮葡萄球菌菌株的生物被膜形成,增加白喉棒状杆菌和某些表皮葡萄球菌菌株生物被膜形成,但不影响牙龈卟啉单胞菌和解脲棒杆菌生物被膜的形成,这提示我们,红霉素对生物被膜的影响因细菌种属不同而不同,而目前尚未见红霉素对木糖葡萄球菌生物被膜形成的影响及其作用机制的研究,故本研究通过蛋白质组学i TRAQ技术,在亚抑菌浓度红霉素干预下筛选木糖葡萄球菌生物被膜形成的差异表达蛋白,为确定红霉素的作用蛋白靶标提供理论支撑。在分析差异表达蛋白的基础上,进一步研究谷氨酰胺合成酶在生物被膜形成中的作用及其是否是红霉素的作用靶标,故采用基因敲除技术获得glnA基因缺失株,证明其不仅在生物被膜形成中发挥作用,而且是红霉素的作用靶标,研究的主要结果如下:(1)基于结晶紫染色法、扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜的方法,揭示亚抑菌浓度的红霉素对生物被膜的干预效果。1/2 MIC(0.8μg/m L)、1/4 MIC(0.4μg/mL)、1/8 MIC(0.2μg/mL)和1/16 MIC(0.1μg/mL)的红霉素显著减少了木糖葡萄球菌生物被膜形成和活菌数,使生物被膜立体结构完全消失。(2)基于蛋白质组学i TRAQ技术,对1/2 MIC(0.8μg/m L)红霉素干预木糖葡萄球菌生物被膜差异蛋白质组定量分析,揭示红霉素可能作用的蛋白靶标。根据差异蛋白选择标准即ratio>2.0 or<0.5(p-value<0.05),筛选并鉴定出24个差异表达蛋白,其中4个(16.7%)蛋白上调表达,20个(83.3%)蛋白下调表达。在上述差异表达蛋白中,如Preprotein translocase subunit Sec G(A0A060MLT7),Fmt B protein(A0A068E3T6),Gluconate permease(A0A068E1W8),Poly-gamma-glutamate synthase subunit Pgs B/Cap B(A0A068E9C1),Sodium/proline symporter(A0A068E9F7),Oligopeptide transport system permease protein Opp B(A0A060MF11)and Sodium/alanine symporter family protein(A0A068E6R7)均属于膜蛋白和细胞表面蛋白,影响细菌黏附作用,因此,这些蛋白在生物被膜形成过程中发挥着重要作用。在上述差异表达蛋白中,Poly-gamma-glutamate synthase subunit Pgs B/Cap B(A0A068E9C1)参与荚膜多糖的生物合成过程,荚膜多糖的生物合成影响生物被膜的形成,故红霉素通过影响荚膜多糖的生物合成过程从而干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成是其发挥作用的机制之一。在上述差异表达蛋白中,Glutamine synthetase(A0A068E8L1)参与谷氨酰胺的生物合成,亚抑菌浓度的红霉素减弱谷氨酰胺合成酶的活性,进而导致谷氨酰胺生物合成的减少。总之,红霉素影响细菌的黏附作用和荚膜多糖的生物合成,减弱谷氨酰胺合成酶的活性导致谷氨酰胺生物合成减少。(3)基于基因敲除技术和分子对接方法,揭示谷氨酰胺合成酶不仅在生物被膜形成中发挥作用,而且是红霉素的作用靶标。glnA基因缺失株形成生物被膜能力明显降低,而当glnA基因缺失株添加谷氨酰胺后,生物被膜形成能力显著性增加。红霉素减少野生菌株生物被膜形成,减弱谷氨酰胺合成酶活性导致谷氨酰胺生物合成减少,然而红霉素对glnA基因缺失株生物被膜形成无影响,也未能改变谷氨酰胺合成酶活性和谷氨酰胺生物合成量。分子对接结果显示红霉素和谷氨酰胺合成酶活性中心直接结合,导致谷氨酰胺合成酶活性下降,260位的组氨酸(His),261位的亮氨酸(Leu),346位的精氨酸(ARG),347位的苯丙氨酸(PHE)为主要结合位点。总之,谷氨酰胺合成酶在生物被膜形成中发挥重要作用,能够与红霉素直接结合是其作用靶标。综上所述,红霉素对木糖葡萄球菌生物被膜的形成具有干预作用,其对膜蛋白、细胞表面蛋白和荚膜多糖的生物合成有影响。谷氨酰胺合成酶参与谷氨酰胺的生物合成,其在生物被膜形成中发挥重要作用。红霉素通过减弱谷氨酰胺合成酶活性,导致谷氨酰胺生物合成减少,干预生物被膜的形成,谷氨酰胺合成酶是其作用靶标。