【摘 要】
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细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是一种区别于细胞坏死，由多种基因调控的主动性细胞死亡过程。目前核医学最常用的凋亡体内检测方法是应用核素标记的AnnexinV。Annexin Ⅴ是一类钙依赖的磷脂结合蛋白，其由319个氨基酸组成，分子量约为35.8kD，属于Annexins蛋白超家族。凋亡早期，原本分布于细胞膜脂质双层的内层磷脂酰丝氨酸暴露于细胞膜外表面；在生理浓度钙离子存在的情况下，AnnexinV和
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细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是一种区别于细胞坏死，由多种基因调控的主动性细胞死亡过程。目前核医学最常用的凋亡体内检测方法是应用核素标记的AnnexinV。
Annexin Ⅴ是一类钙依赖的磷脂结合蛋白，其由319个氨基酸组成，分子量约为35.8kD，属于Annexins蛋白超家族。凋亡早期，原本分布于细胞膜脂质双层的内层磷脂酰丝氨酸暴露于细胞膜外表面；在生理浓度钙离子存在的情况下，AnnexinV和带负电荷的磷脂酰丝氨酸具有很高的亲和力。通过检测放射性核素标记的AnnexinⅤ，就可以对生物体内发生的凋亡进行直观性、无创性、实时性的观测。
本实验研究目的，通过分子生物学方法建立简便、高效的具有内在金属螯合位点的突变型人AnnexinⅤ生产方法，并进行同位素标记及初步的显像研究。
研究方法：
1、人Annexin Ⅴ在原核生物大肠杆菌中的表达与纯化。
2、突变型人Annexin Ⅴ在真核生物酵母中的表达与纯化。
3、通过与FITC标记的AnrlexinⅤ竞争结合外露磷脂酰丝氨酸的红细胞测定突变型人Annexin Ⅴ活性。
4、对AnnexinⅤ进行<99m>Tc同位素标记，并测定其标记率、放射性化学纯度和体外结合活性。
5、<99m>Tc-Annexin Ⅴ稳定性的测定。
6、<99m>Tc-Annexin Ⅴ在正常小鼠和荷S-180肉瘤小鼠体内分布的研究。
结果：
1、大肠杆菌工程菌可以生产AnnexinⅤ。
2、毕赤酵母系统表达的蛋白直接分泌到培养基中，经过简单的纯化步骤就可以得到纯度即可到达95％，大大降低了人Annexin生产所需的费用和时间。
3、突变型人AnnexinⅤ的半数抑制浓度为4nmol/1。
4、<99m>Tc-AnnexinⅤ标记率为60％，经Sephadex G-25柱纯化后放化纯度达到92％，活性为67％。
5、<99m>Tc-AnnexinⅤ稳定性佳，6h后放化纯度和活性无明显降低。
6、正常小鼠体内生物分布试验表明，<99m>Tc-Annexin Ⅴ主要聚集在肾脏、肝脏、脾脏，并通过肾脏进行排泄。荷S-180肉瘤小鼠体内分布肿瘤与正常组织摄取率之比T/M和T/B从0.5h到6.0h，呈现逐渐增加的趋势，到<99m>Tc-Annexin Ⅴ注射后6.0h达到最高，T/M达到5.71。
结论：
本课题为国内首家通过毕赤酵母表达生产人AnnexinⅤ，其生产效率高，纯化简便；而且其具有内在的金属螯和位点简化了同位素标记方法，拚除了国内外常用的双功能连接剂HYNIC对标记物最终分子构象的影响，为利用<99m>Tc标记AnnexinV进行活体凋亡显像作出新的有益尝试。
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