目的筛选与乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移相关的目的基因,并探究沉默目的基因对MDA-MB-231细胞侵袭的影响,为寻求三阴性乳腺癌的治疗靶点提出新的思路及切入点。方法1.首先针对20个待检基因各设计3个RNA沉默靶点,将携带不同沉默靶点的3个质粒以单独及等比例混合两种方式进行慢病毒包装,感染MDA-MB-231细胞,分别称为shRNA1、shRNA2、shRNA3以及shRNA。本实验同时设置阴性对照组(NC组)。2.利用高内涵筛选划痕实验,通过Celigo系统收集细胞迁移图像并进行数据分析,比较各组细胞的划痕愈伤能力。从20个待检基因之中挑选出与细胞迁移有关的基因,称为目的基因。3.通过蛋白质免疫印迹法(western blot,WB)对目的基因的3个shRNA进行蛋白表达情况的测定,选出沉默效率最好的一组继续后续实验。4.应用Transwell体外侵袭实验,检验目的基因的下调对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。5.采用WB方法,检测目的基因沉默后乳腺癌细胞中上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达情况,从而进一步分析目的基因对MDA-MB-231细胞转移的影响。结果1.HCS划痕实验显示,CPNE1-shRNA、KCTD14-shRNA、FUNDC2-shRNA组迁移能力较NC组明显减弱(Fold change>2),表明KCTD14,CPNE1,FUNDC2为HCS筛选的与迁移相关的目的基因。2.WB表明CPNE1、KCTD14基因沉默组中shRNA1组相应蛋白表达减少最明显,FUNDC2基因沉默组中shRNA2组相应蛋白表达减少最明显。3.Transwell实验显示沉默CPNE1、KCTD14、FUNDC2基因MDA-MB-231细胞侵袭能力较NC组均显著减弱。4.WB实验显示CPNE1-shRNA1、KCTD14-shRNA1组EMT相关蛋白vimentin、snail、TCF8/ZEB1表达量均较NC组减少;FUNDC2-shRNA2组vimentin、TCF8/ZEB1表达量均较NC组减少。结论1.沉默CPNE1、KCTD14、FUNDC2基因抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭能力。2.沉默CPNE1、KCTD14、FUNDC2降低MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白的表达水平。