草鱼自古以来就是中国当家品种，但是长期以来备受病害的侵袭，让养殖场等遭受很大的经济损失，由草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病尤为突出。引起草鱼出血病的是草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)，可导致草鱼鱼种发生阶段性出血病，死亡率高达90%以上，还能感染青鱼、麦穗鱼和稀有鮈鲫等。当前尚无有效对抗出血病毒的药物，因此对该病毒的亚单位疫苗研究具有都十分重要的意义。本文主要的研究主要分两个方面：1、GCRV的外壳蛋白基因vp5、vp7的克隆和原核表达，多克隆抗体的制备以及其病毒中和能力分析实验本实验室在江西某草鱼养殖场的患出血病病鱼体上分离到一株具强致病力的病毒株(命名为GCRV-JX01,GenBank: JQ042807.1)，根据GeneBank上草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白基因vp5和vp7的全基因组序列来设计引物，提取感染出血病毒草鱼的RNA为模板，并对目的基因进行扩增，然后将其克隆到表达载体pGEX-4T-3质粒中，转化入Escherichia coli DH5α中，经PCR删选出阳性菌种并送生物公司测序确认。所得阳性菌株经IPTG诱导和SDS-PAGE分析后，分别获得大小分别为90kDa和52kDa的重组蛋白pGEX-4T-VP5和重组蛋白pGEX-4T-VP7。SDS-PAGE的结果显示出两种目的蛋白的存在形式均是包涵体。割胶回收并用小量蛋白回收试剂盒（生工）纯化，将纯化产物分别作为免疫原注射BALB/c小鼠，分别获得抗VP5血清（anti-vp5）和抗VP7血清（anti-vp7）的多克隆抗体，并采用体外微量中和实验分析多克隆抗体血清anti-vp5和anti-vp7的中和能力。Western blot分析显示anti-vp5和anti-vp7均可以和诱导蛋白发生特异性的免疫反应。微量中和实验及病毒滴度实验结果证明anti-vp5和anti-vp7多抗血清能够特异性中和呼肠孤病毒粒子，并且能够有效的阻止它的感染，其中VP7抗血清中和效价比VP5的抗血清的中和效价高很多。这一结果为草鱼呼肠孤病毒的免疫检测方法的建立提供了技术基础。2、基于GCRV外衣壳蛋白免疫原性的病毒血清学诊断技术研究实验频繁爆发的草鱼出血病给草鱼养殖带来很大的困扰，虽然基于核酸的各种诊断方法有被证明是有效的，但是由于缺乏草鱼IgM的单克隆抗体所以没有可靠并商业化的免疫学检测GCRV感染的方法。所以本文介绍了制备抗草鱼IgM恒定区的单克隆抗体的方法，及开发了基于GCRV的外衣壳蛋白VP7作为抗原的免疫学的检测方法检测GCRV的感染。本文根据草鱼免疫球蛋白IgM的序列，设计草鱼IgM重链的恒定区CH1和CH2的表达引物进行PCR扩增，将扩增片段克隆至表达载体pET-16B-1,采用PCR删选阳性菌株并送测序确认。将阳性菌株在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中，经过IPTG诱导后，获得重组蛋白pET-16B-CH1和pET-16B-CH2，凝胶电泳分析结果显示两种蛋白都以包涵体形式存在。重组蛋白rCH1和rCH2利用组氨酸蛋白纯化树脂进行纯化表达产生重组蛋白，并以纯化重组蛋白rCH1和rCH2作为免疫原，分别免疫BALB/c小鼠获得CH1和CH2的多抗血清，取实验结果效价高的小鼠脾细胞与SP2/0瘤细胞融合，然后两次筛选，再克隆后得到8株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过ELISA及Western blot方法筛选出能稳定分泌抗草鱼IgM的单克隆抗体，分别命名2E8（抗CH1），3A2（抗CH2）。利用2E8和3A2两株单克隆抗体检测抗草鱼呼肠孤病毒的抗体来验证获得鼠抗的草鱼IgM的抗血清。经免疫印迹检测,表明两株单克隆抗体都可以特异性的识别纯化的草鱼IgM；将纯化后的GCRV病毒粒子和rVP7蛋白分别免疫草鱼，并在免疫7、14、28、32天采集草鱼血清。这些免疫后的草鱼血清以及从江西南昌和广东广州采样回来的病样草鱼血清都作为草鱼血清样本，运用ELISA、RT-PCR、Western blot、Dot-blot等方法将rVP7作为抗原进行检测，证实VP7蛋白的免疫原性。ELISA、RT-PCR、Western blot、Dot-blot等检测方法检测出来的结果基本一致，发现草鱼血清通过单克隆抗体2E8和3A2都能特异性的识别草鱼IgM中的抗VP7抗体。这些结果说明了所制备的单克隆抗体可以识别到草鱼免疫应答的病原体，也进一步验证了VP7具有很好的免疫原性，可以作为草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗的有效组分。本文的研究为今后对草鱼呼肠孤病毒的抗原检测及应用基于单克隆抗体检测病毒的免疫学方法做了铺垫。